目的：柯萨奇病毒B组3型（Coxsackievirus group B type3，CVB3）感染所致的病毒性心肌炎严重危害人类健康，也是新生儿猝死的重要原因，迄今尚无有效的预防方法。VP1是CVB3的主要衣壳蛋白，可诱导机体产生免疫应答。研究表明，编码VP1的DNA疫苗能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答，并对小鼠有一定的保护能力，但不能有效阻止致死量病毒感染。　　 目前提高免疫效果的关键因素之一是开发具有较高基因转移率和靶向特异性的转基因载体。在众多载体体系中，复制缺陷型腺病毒载体系统以其广泛的宿主范围、极高的转染效率、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点，在疫苗载体选择中表现出优势，成为极具应用前景的基因转移载体。但由于腺病毒载体自身免疫原性较强，对自身抗原产生免疫应答而不能多次应用。　　 蛋白质有很强的免疫原性，免疫动物可诱导产生高效价的抗体。从病原体中提取具有免疫保护作用的蛋白，或利用DNA重组技术使重组体表达蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗，称为亚单位疫苗。亚单位疫苗不含感染性组分，无须灭活，也无致病性。但也有研究表明，某些病原体亚单位疫苗的免疫原性低，不能达到满意的免疫保护作用。　　 近年有研究显示，采用prime-boost方法将不同疫苗联合应用能明显提高免疫效果。本研究采用prime-boost方法将CVB3重组腺病毒Ad/vp1与CVB3/VP1 DNA疫苗或CVB3VP1蛋白疫苗联合应用免疫小鼠，观察免疫效果。　　 方法：　　 1.将前期构建的原核表达质粒 pET-his/VP1转入表达宿主菌BL21（DE3）pLysS，诱导表达携带有6×HIS标签的VP1蛋白，分别利用HIS单抗和CVB3多抗经Western-blot鉴定无误后对目的蛋白进行优化表达。将大量诱导表达的菌体在冰浴中超声破碎，分离上清和包涵体沉淀，对该蛋白的水溶性进行分析。将包涵体溶液经金属镍离子基质亲和层析柱纯化，获得纯化的蛋白。　　 2.用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/VP1，用聚乙二醇沉淀法进行纯化。　　 3.将本室前期构建的Ad/vp1第三代病毒液感染293细胞，逐日观察细胞病变，待80％的细胞出现病变后，收集细胞和培养液，用GENMED腺病毒沉淀法纯化试剂盒纯化。　　 4.动物实验：将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为（1）～（8）组，每组18只。分别为（1）PBS组：肌肉注射PBS，每3周1次，共3次；（2）质粒组：肌肉注射pcDNA3/VP1，每3周1次，共3次；（3）腺病毒组：肌肉注射Ad/vp1，每3周1次，共2次；（4）质粒/腺病毒组：第1、2次注射pcDNA3/VP1，第3次注射Ad/vp1，各次间隔3周；（5）腺病毒/质粒组：第1次注射Ad/vp1，第2、3次注射pcDNA3/VP1，各次间隔3周；（6）蛋白/腺病毒组：第1、2次注射VP1蛋白，第3次注射Ad/vp1，各次间隔3周；（7）腺病毒/蛋白组：第1次注射Ad/vp1，第2、3次注射VP1蛋白，各次间隔3周；（8）蛋白组：每3周注射1次，共3次。质粒采用股四头肌接种，接种前注射25％高渗蔗糖溶液100μl，20min后原位注射质粒100μg/100μl；VP1蛋白以PBS稀释后，采用肌肉注射免疫，每次接种100μg/只。初次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂；重组腺病毒Ad/vp1以PBS稀释，每次肌肉接种4×107pfu/只。每次免疫后第14天，内眦静脉取血，分离血清，用微量中和试验检测血清CVB3特异性中和抗体，用ELISA检测IgG抗体；第三次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK一8）法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）杀伤活性的检测；另每组12只小鼠用致死量的CVB3（4.5LD50）进行腹腔注射，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天；每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击，注射病毒后第7天采血，测定血中病毒滴度。　　 结果：　　 1.酶切鉴定结果证实成功提取了真核表达重组质粒pcDNA3/VP1。　　 2.在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中成功表达了CVB3 VP1蛋白，表达蛋白主要以包涵体形式存在。　　 3.用293细胞大量扩增了重组腺病毒并进行了纯化。　　 4.每次免疫后14天，取血，测各组血清中和抗体的平均效价分别为：PBS对照组未检测到；pcDNA3/VP1质粒组1：5.30，1：17.82，1：23.78；腺病毒组1：5.61，1：15.87；质粒/腺病毒组1：5.30，1：17.82，1：29.96；腺病毒/质粒组1：5.61，1：17.82，1：28.28；蛋白/腺病毒组1：8.91，1：47.56，1：67.26；腺病毒/蛋白组1：5.61，1：16.82，1：56.56；蛋白组1：8.91，1：47.56，1：71.26。单因素方差分析表明，除PBS对照组外，其余各组中和抗体滴度逐次增加（P<0.05）；第三次免疫后，蛋白组中和抗体滴度高于质粒pcDNA3/VP1组和腺病毒/蛋白组（P<0.05）。　　 5.测各组血清特异性IgG抗体水平分别为：PBS组各次效价均低于1：50；质粒组1：50，1：640，1：960；腺病毒组1：70，1：880；质粒/腺病毒组1：50，1：640，1：2880；腺病毒/质粒组1：70，1：360，1：1280；蛋白/腺病毒组1：440，1：17920，1：23040；腺病毒/蛋白组1：70，1：2880，1：20480；蛋白组1：440，1：21333，1：38400。单因素方差分析表明，除PBS对照组外，其余各组IgG抗体滴度逐次增加（P<0.05）；第三次免疫后，蛋白组IgG抗体滴度高于PBS组、腺病毒组、质粒pcDNA3/VP1组、蛋白/腺病毒组、腺病毒/蛋白组（P<0.05）；质粒/腺病毒组抗体滴度也高于质粒pcDNA3/VP1组。　　 6.小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验分别以CVB3和刀豆蛋A（concanavalin A，ConA）体外刺激淋巴细胞，检测细胞增殖活性。单因素方差分析表明，蛋白参与各组的增殖活性均显著高于PBS组和质粒组（P<0.05）。　　 7.特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明，质粒/腺病毒组、腺病毒/质粒组、蛋白/腺病毒组、腺病毒/蛋白组、蛋白组小鼠的CTL特异性杀伤率明显高于PBS组（P<0.05）；　　 8.用4.5LD50攻击小鼠，各组21天生存率分别为：蛋白组生存率达42％；质粒/腺病毒组生存率为33％；蛋白/腺病毒组生存率为25％；腺病毒/蛋白组和腺病毒/质粒组生存率为17％；腺病毒组和质粒组生存率为8％；PBS组无存活。用Kaplan-Meier法进行生存分析表明，各组生存率曲线分布有差别（P<0.05），进一步两两比较说明，蛋白组、质粒/腺病毒组与PBS对照组比较有统计学意义（P<0.05）；蛋白组与质粒组和腺病毒组比较有显著差别（P<0.05）。　　 9.与PBS对照组相比，各免疫组小鼠血中病毒滴度显著降低（P<0.05）；且蛋白/腺病毒组、腺病毒/蛋白组、蛋白组与腺病毒组相比血中病毒滴度显著降低（P<0.05）；蛋白组与腺病毒/蛋白组相比血中病毒滴度也显著降低（P<0.05）。　　 结论：　　 1.成功制备了真核表达质粒pcDNA3/VP1、CVB3VP1蛋白和重组腺病毒Ad/vp1。　　 2.除PBS对照组外，各组血清中和抗体滴度、IgG抗体效价随免疫次数的增加而提高。三次免疫后，蛋白/腺病毒组、腺病毒/蛋白组、蛋白组中和抗体和IgG抗体水平均高于DNA疫苗参与组。　　 3.质粒/腺病毒组和蛋白/腺病毒组能够增强小鼠淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤水平。　　 4.用致死量CVB3攻击小鼠后，各免疫组能降低血中病毒载量，质粒/腺病毒组、蛋白/腺病毒组、蛋白组的小鼠生存率和存活时间高于其他组。