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流感是一种急性的经呼吸道传播的疾病，无论是对动物养殖业还是人类健康均造成严重的危害。流感变异是一种自然选择的过程，流感病毒在猪体内最易重组，因为猪作为流感病毒的易感动物，可同时感染多种不同亚型的流感病毒，容易造成相互间的重组。2009年以来，不断有新的甲型H1N1流感病毒重新感染到猪体内的报道，因此应对新分离到的甲型H1N1病毒基因组做全面的特征鉴定，这样未来的基因重组事件或基因变异可被人们快速地识别和确定。本研究旨在通过对新分离到的甲型H1N1流感病毒的全基因序列分析，了解甲型H1N1流感病毒的遗传信息，并研制出猪用甲型H1N1流感疫苗，为预防将来甲型H1N1流感病毒在猪群中的大流行提供技术储备。 本文对2010年分离自广东的人源甲型H1N1流感病毒A/Guangdong/1057/2010进行了全基因组的克隆及序列分析。结果表明该毒株的8个基因片段与2009年至2010年流行的甲型H1N1流感病毒亲缘性较近，具有低致病性流感病毒的基因特征。对该毒株HA蛋白氨基酸序列的分析结果表明，在糖基化方面，该毒株的HA肽链上有8个潜在的糖基化位点，分别位于HA1上的27(NNS)、28(NST)、40(NVT)、104(NGT)、293(NTT)、304(NTS)位，HA2上的498(NGT)和557(NGS)位，这与新甲型H1N1流感参考毒株一致。与H1N1亚型禽源猪流感毒株和人季节性H1N1亚型流感毒株相比，在293位增加了一个糖基化位点(NTT)，这与近年来经典猪H1N1病毒完全一致。对受体结合位点的氨基酸分析发现，该毒株HA蛋白的169和173位氨基酸分别是V和N，是典型的猪流感病毒特征。大多数经典猪流感病毒和禽源猪流感病毒以及2000年之后分离到的人季节性H1N1亚型流感病毒在200位氨基酸是P，而1057株和新甲型H1N1流感病毒则为S，在约1999年以前分离到的人季节性H1N1亚型流感病毒的第200位也主要是S。总之，该毒株的HA蛋白受体结合位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。对该毒株的其它基因进行序列分析的结果表明，该毒株的变异以点突变为主，虽然这些突变不在重要的抗原位点上，但点突变的累积作用能否导致病毒的毒力增强值得关注。 本研究还利用流感病毒的反向遗传8质粒操作系统成功拯救了重组病毒1057-1和1057-2，前者以PR8毒株作为骨架，替换了1057毒株的HA基因，后者以PR8作为骨架，替换了1057毒株的HA基因和NA基因。对此两株病毒进行部分生物学特性的测定，对MDCK细胞、鸡胚均具有良好的适应性，在MDCK细胞的血凝效价分别为26和26，在鸡胚上的血凝效价分别为26和27，EID50分别为10-5.1/0.1mL1和10-6.1/0.1mL，可感染小鼠和猪，未见典型发病症状。对重组病毒1057-2株遗传稳定性进行了测定，该毒株能适应在鸡胚上繁殖，经20代次传代后其HA效价没有下降，所有代次的HA效价几何平均数都保持在27以上。 本研究以重组病毒1057-2作为抗原成功制备了4种重组甲型H1N1流感灭活疫苗，其中GELA疫苗和GELB疫苗为水基免疫佐剂疫苗，前者为甲醛灭活，后者为BEI灭活；15AA疫苗和15AB疫苗为水包油型疫苗，前者为甲醛灭活，后者为BEI灭活。4种疫苗质量检测和安全性检测合格。选择BALB/c小鼠作为动物模型，选用4种重组甲型H1N1流感灭活疫苗进行免疫试验，HI检测结果表明：4种疫苗均可以诱导小鼠产生较高水平的针对1057毒株和3毒株的HI抗体，但GEL佐剂制备的疫苗明显优于15A佐剂制备的疫苗，甲醛灭活疫苗免疫效果稍优于BEI灭活疫苗。GELA免疫组在免疫后1周即可诱导产生针对甲型H1N1流感病毒1057株的HI抗体，抗体滴度为53±7，二免后第4周抗体达到峰值4267±853，二免后第8周HI抗体水平仍可达到2880±805。小鼠攻毒保护试验表明，4种疫苗均可有效保护甲型H1N1流感病毒和猪流感病毒(H1N1)的攻击，但GEL佐剂组可达完全保护。 为了评价4种疫苗在本体动物上的免疫性，将4种重组甲型H1N1流感灭活疫苗免疫猪，HI检测结果表明：GEL佐剂制备的疫苗可以诱导猪体产生较高水平的针对甲型H1N1流感病毒、猪流感病毒(H1N1)的HI抗体，15A佐剂制备的疫苗诱导机体产生HI抗体的能力较差。甲醛灭活疫苗的免疫效果稍优于BEI灭活疫苗。GELA免疫组在免疫后1周即可诱导产生针对甲型H1N1流感病毒1057株的HI抗体，抗体滴度为30±9，二免后第2周抗体达到峰值800±326，二免后第8周HI抗体水平下降至31±13。猪攻毒保护试验表明，4种疫苗均可有效保护甲型H1N1流感病毒和猪流感病毒(H1N1)的攻击，但GELA疫苗组可达完全保护。 本研究的创新点在于对甲型H1N1流感病毒流行毒株进行了全基因测序和序列分析，与2009年至2010年流行的甲型H1N1流感病毒高度同源，未出现新的基因重组，但发现了基因点突变现象，为进一步监测病原变异、致病性及流行规律提供科学依据。利用反向遗传操作技术构建了新型猪用甲型H1N1流感疫苗候选毒株，并成功研制出专用于猪的甲型H1N1流感灭活疫苗，筛选出最优的佐剂，可以有效预防甲型H1N1流感在猪群的暴发流行。