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目的探讨沉默及过表达NRP-1基因对乳腺癌细胞生物学行为的影响；并对GST-NRP-1融合蛋白进行原核表达,为深入研究NRP-1对乳腺癌的调控机制奠定基础。方法利用RT-qPCR及Western blot技术筛选用于沉默及过表达NRP-1基因的乳腺癌细胞株MCF-7. SK-BR-3和MDA-MB-231。1.设计并合成3对靶向人NRP-1的特异性干扰序列和1对非特异性对照序列；构建pLB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒,感染细胞后,用流式细胞仪筛选出GFP阳性细胞；RT-qPCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测NRP-1的表达,并筛选出沉默效率最高的干扰序列；CCK-8法及AV-PI法结合流式细胞仪(FCM)检测RNA干扰NRP-1基因及联合EPI后对细胞增殖、凋亡的影响；RT-qPCR检测MCF-7. SK-BR-3细胞经表柔比星处理后干扰组与对照组增殖与凋亡相关基因mRNA表达水平的变化。包括增殖相关基因CDK6、c-Myc,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1,促凋亡基因Bak、Bax。2.构建过表达载体pcDNA3.1-NRP-1,采用脂质体转染的方法将NRP-1基因转染入乳腺癌MDA-MB-231及SK-BR-3细胞,经G418筛选后获得稳定高表达NRP-1的亚克隆细胞系。RT-qPCR、Western-blot技术鉴定NRP-1基因转染后的表达；CCK-8法检测细胞增殖及对细胞EPI敏感性的变化。流式细胞术检测NRP-1过表达及EPI处理后细胞凋亡的变化。Transwell实验检测NRP-1过表达后对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭的影响；RT-qPCR检测MDA-MB-231、 SK-BR-3细胞经表柔比星处理后过表达组与对照组增殖与凋亡相关基因InRNA表达水平的变化。包括增殖相关基因CDK6、c-Myc,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1,促凋亡基因Bak、Bax。3.构建重组质粒pGEX-4T-1-NRP-1,转入BL21(DE3)感受态细胞以ITPG诱导蛋白表达。考马斯亮蓝染色方法及Western blot显示融合蛋白以包涵体的形式表达,通过探索诱导剂IPTG浓度和诱导时间对诱导条件进行优化。后表达的包涵体经复性后用Glutathione Sepharose4B纯化。结果RT-qPCR及Western blot筛选结果显示：NRP-1都有表达,MCF-7表达量较高,MDA-MB-231表达量较低,因此筛选MCF-7、SK-BR-3细胞用于干扰部分实验,MDA-MB-231、SK-BR-3细胞用于过表达部分实验；1.成功构建了pLB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒,重组慢病毒滴度达108IU/mL;重组慢病毒颗粒感染后,MCF-7及SK-BR-3细胞特异性干扰组NRP-1mRNA和蛋白表达量均明显低于对照组；2.CCK-8法结果显示：MCF-7细胞及SK-BR-3细胞NRP-1/shRNA组于48h、72h、96h的OD值均低于相应对照组,且差异有统计学意义(P<0.05);经不同浓度的表柔比星处理后,MCF-7对照组和NRP-1/shRNA组细胞的IC50分别是(2.0±0.035)μmol/L和(0.750±0.021)μmol/L, SK-BR-3对照组和NRP-1/shRNA组细胞的IC50分别是(1.3±0.028)μmol/L和(0.8±0.021)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)；流式细胞仪检测凋亡率显示：MCF-7细胞及SK-BR-3细胞NRP-1干扰组的凋亡率均高于相应对照组,且差异有统计学意义(P<0.05);MCF-7细胞经2.0μg/mL EPI处理24h,SK-BR-3细胞经1.3μg/mL EPI处理2411后,干扰组的凋亡率均较对照组增加(P<0.05)；RT-qPCR结果显示经表柔比星处理后干扰组CDK6、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL mRNA表达水平较对照组明显降低,BaxmRNA表达水平较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05), Mcl-1、Bak mRNA表达水平干扰组与对照组相比无明显变化(P>0.05)。3.成功构建了稳定高表达NRP-1基因的表达载体pcDNA3.1-NRP-1;脂质体转染后,MDA-MB-231细胞及SK-BR-3细胞过表达组NRP-1mRNA和蛋白表达量均明显高于对照组,有统计学意义(P<0.05)。4.CCK-8法结果显示:MDA-MB-231细胞及SK-BR-3细胞pcDNA3.1-NRP-1组于24h、48h、72h的OD值均高于相应对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)；经不同浓度的表柔比星处理后,MDA-MB-231对照组和pcDNA3.1-NRP-1组细胞的IC50分别是(2.3±0.01)μmol/L和(6.0-±0.015)μmol/L, SK-BR-3对照组和过表达组细胞的IC50分别是(1.3±0.028)μmol/L口(1.9±0.021)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)；流式细胞仪检测结果显示MDA-MB-231细胞及SK-BR-3细胞NRP-1过表达组的凋亡率均低于相应对照组,且差异有统计学意义(P<005); MDA-MB-231细胞经23μg/mL EPI处理24h,SK-BR-3细胞经1.3μg/mLEPI处理24h后,过表达组的凋亡率均较对照组增加(P<0.05)；Transwell小室迁移及侵袭实验显示,过表达组穿膜细胞数较空载体组及正常组明显升高,差异有统计学意义(p>0.05)；RT-qPCR结果显示经表柔比星处理后过表达组CDK6、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL mRNA表达水平较对照组明显升高,Bax mRNA表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05),Mcl-1、Bak mRNA表达水平过表达组与对照组相比无明显变化(P>0.05)。5.成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-NRP-1,转入感受态细胞BL21(DE3), IPTG诱导后,考马斯亮蓝染色及Western blot结果显示约100kD处出现了一条新的蛋白条带,主要以包涵体形式获得表达。在诱导剂IPTG浓度为0.2mmol/L,诱导表达6h后,蛋白GST-NRP-1达到最大表达量。透析复性法探索得到蛋白复性最佳条件,与Glutathione Sepharose4B结合,经谷胱甘肽洗脱后行考马斯亮蓝染色,结果显示有融合蛋白的表达且纯度可。结论1RNAi沉默NRP-1基因后可抑制乳腺癌细胞增殖,促进其凋亡,提高其表柔比星敏感性,其机制可能与CDK6、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL表达水平的下调和Bax表达水平的上调有关。2.NRP-1过表达后可促进乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭,抑制其凋亡,降低表柔比星药物敏感性,其机制可能与CDK6、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL表达水平的上调和Bax表达水平的下调有关。3.获得GST-NRP-1融合蛋白的原核表达并实现了融合蛋白的条件优化；经包涵体复性后得到纯化的融合蛋白。