目的:1、建立重症急性胰腺炎相关肺损伤的动物模型,了解大鼠肺功能受损后的病理改变。2、建立一种分离纯化、培养扩增,荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞方法,为利用MSCs进行肺损伤的细胞治疗提供实验基础。3、通过骨髓间充质干细胞移植治疗肺损伤的大鼠,评价其对大鼠肺功能的保护作用。方法:1、采用改进的胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠造成大鼠急性出血坏死型胰腺炎(AHNP)模型,将大鼠分为2组,SAP组健康雄性SD大鼠,250g~350g,氯胺酮麻醉并固定大鼠,于腹前正中线开腹,分层剪开皮毛、腹肌暴露十二指肠,提起十二指肠,显露肝门部,沿胆总管主干寻找至汇入十二指肠处,缝扎胆胰管末端进入十二指肠处,5 min后,见胆胰管均较前充盈,乃以动脉夹钳夹肝总管近侧端,于主胰管进入十二指肠处的对侧肠壁,向肝门方向以4~#针头穿刺胆管,缓慢推入牛磺胆酸钠(速度为0.2 ml/min) ,剂量为1 ml/kg。对照组大鼠仅作假手术。2、差异贴壁法获得MSCs:用DMEM-F12不断冲洗SD大鼠的股骨和胫骨的骨端。抽取相对密度1.073 g/mL的Ficoll分离液,将冲洗下的细胞悬液混合分离液,2500rpm离心25min,弃去上清液,用含10%~15%胎牛血清培养液重悬后,接种于25cm~2培养瓶,在37℃,5% CO2,饱和湿度CO2培养箱内培养,24小时后没有贴壁的细胞被丢弃。每星期两次的跟换细胞培养液,观察细胞生长、贴壁情况。细胞生长至培养瓶面积约90%时传代,根据细胞生长情况1:2。传至第3代时,胰酶消化,收获细胞,流式细胞仪检测。获取雄性SD大鼠的MSCs,传代、增殖、纯化。将第3代MSCs用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记,荧光显微镜观察标记率。再将MSCs制成细胞悬液,浓度为1×10~6/ml,于造模前1h,通过尾静脉注射到大鼠体内,1ml/只。3、对照组尾静脉注射等量生理盐水。于输注后1h、3h、6h、12h、24h分批处死大鼠,获取血液、肺组织等标本。检测血液IL-1β、IL-10、TNF-α、MIP-α、AYM的浓度。肺组织部分行快速冰冻,荧光显微镜下观察DAPI阳性细胞;部分常规HE染色,观察肺组织受损情况。实时定量PCR测定肺组织TNF-α、SP量的测定。结果:1、对照组大鼠血清淀粉酶水平1468±105.5U/L。造模组大鼠在造模后3小时起,血淀粉酶水平显著升高,至12小时达到高峰10249±1392U/L。显微镜下观察对照组胰腺组织结果清晰,间质无渗出。病理评分为0.14±0.12。造模组病理评分显示12h达到顶点。显微镜下观察,造模12h可见间质明显水肿、大量中性粒细胞浸润。病理评分为6.68±0.64。造模组3、6、12h肺通透性指数、湿干比值均高于对照组。2、显微镜观察原代接种48h即可见很多细胞贴壁,外观呈多角形, 72h后细胞数量贴壁开始增多,细胞形态呈成短小纤维细胞样长梭形,培养至8d左右细胞汇合达到90%左右,细胞呈极性排列,集落呈漩涡状。经过换液和传代后,MSC细胞逐渐纯化,传至第3代时,细胞形态比较均一,呈膜状铺展。3、MSCs组比SAP组血清的淀粉酶有显著下降并在12小时达到高峰.湿干比值是高提示肺水肿的存在,MSCs组比SAP组的湿干比明显下降。苏木精-伊红染色结果显示,假手术组(SO组)的肺泡组织结构正常,SAP组肺组织出现肺损伤改变。MSCs组的肺组织病理变化较轻。PCR测定显示在干细胞治疗组中的TNF-α、SP的量明显低于SAP组。结论:1、牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射造成AHNP模型大鼠于术后6H即出现明显的肺损伤表现,符合PALI病理改变,与临床SAP合并急性肺损伤(ALI)的病理过程相似,可作为研究SAP合并肺损伤的模型。2、全骨髓差异贴壁法能够获得较高纯度的MSCs,为后续实验提供了充足的MSCs来源。3、重症急性胰腺炎能够引起大鼠全身性炎症反应,移植的MSCs能够迁移并定居到受损肺组织,对重症急性胰腺炎相关肺损伤有一定的治疗作用。