【摘 要】
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研究目的:研究报道,tau蛋白的磷酸化受许多蛋白激酶调节,而tau蛋白的磷酸化激酶和磷酸酶失调会导致阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的发生;micro RNA（miRNA）在AD患者脑组织中的表达失调,miRNA可调控蛋白激酶的蛋白水平或其活性,从而影响tau蛋白的磷酸化;褪黑素可调节多种miRNA并参与神经分化等生物学过程。本课题组的前期研究均发现,褪黑素可减少tau
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研究目的:研究报道,tau蛋白的磷酸化受许多蛋白激酶调节,而tau蛋白的磷酸化激酶和磷酸酶失调会导致阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的发生;micro RNA（miRNA）在AD患者脑组织中的表达失调,miRNA可调控蛋白激酶的蛋白水平或其活性,从而影响tau蛋白的磷酸化;褪黑素可调节多种miRNA并参与神经分化等生物学过程。本课题组的前期研究均发现,褪黑素可减少tau蛋白的过度磷酸化。因此,我们想探究褪黑素是否通过靶向miRNA来调节tau蛋白的磷酸化激酶,进而抑制AD的发生和发展,有望为AD的治疗提供新靶点。研究方法:1.选取C57BL/6野生型小鼠和h Tau转基因小鼠为动物模型,采用褪黑素（治疗组）和生理盐水（安慰组）分别对h Tau转基因小鼠进行干预,C57BL/6野生型小鼠不做任何处理（健康组）。采用免疫组织化学染色法检测小鼠脑组织中tau的磷酸化水平蛋白,并通过1%（w/v）N-月桂酰肌氨酸钠盐分离可溶性和不可溶性tau蛋白,采用Western blot技术检测tau蛋白的磷酸化水平,探索褪黑素对AD中tau蛋白过度磷酸化的影响。2.采用硫磺素-S染色法检测小鼠脑组织中的神经原纤维缠结（neurolfibrillary tangles,NFTs）,探索褪黑素对AD中神经原纤维缠结的影响。3.通过高通量测序技术对治疗组和安慰组进行miRNA测序,并通过文献报道和数据库分析,确定候选miRNA及其候选靶基因。4.采用分子克隆技术将p39 3’UTR-Wt和p39 3’UTR-Mut连接到双荧光素酶报告基因载体上,并将这两个质粒分别与miR-504-3p mimics共转染到293T细胞中检测相对荧光素酶活性,探索miR-504-3p与p39的相互作用。5.将miR-504-3p mimics转染至N2a细胞中,采用Western blot技术检测检测p39的蛋白水平。Cdk5磷酸化tau蛋白位点的磷酸化水平,并采用q RT-PCR技术检测p39的m RNA水平,探索miR-504-3p是否影响p39的表达水平和Cdk5磷酸化tau蛋白的激酶活性。6.使用褪黑素对miR-504-3p敲除的细胞模型进行干预,采用Western blot技术检测p39的蛋白水平和Cdk5磷酸化tau蛋白位点的磷酸化水平,并采用q RT-PCR技术检测p39的m RNA水平,探索褪黑素是否通过增加miR-504-3p的表达水平抑制AD中的tau蛋白病变,即抑制miR-504-3p是否逆转褪黑素对AD中tau蛋白病变的影响。研究结果:1.免疫组织化学染色法和Western blot技术的结果均显示,与安慰组相比,褪黑素治疗组的h Tau小鼠脑组织中tau蛋白的磷酸化水平显著降低。可溶性中总tau蛋白水平没有改变,不可溶性中总tau蛋白水平也降低。2.与安慰组相比,褪黑素治疗组的h Tau小鼠脑组织中神经原纤维缠结（neurolfibrillary tangles,NFTs）数目明显减少。3.测序结果发现,与安慰组相比,褪黑素治疗组的h Tau小鼠脑组织中的12个miRNAs表达量显著上调,5个显著下调,并确定候选miRNA miR-504-3p及其候选靶基因p39。4.双荧光素酶报告实验结果显示,p39 3’UTR-Wt载体共染组的相对荧光素酶活性显著降低。而p39-3’UTR-Mut组的相对荧光素酶活性没有明显变化。5.结果显示,miR-504-3p过表达的N2a细胞中,p39的m RNA和蛋白水平以及tau蛋白的磷酸化水平均显著降低。6.结果显示,采用褪黑素进行干预的miR-504-3p敲除的N2a细胞中,p39的m RNA和蛋白水平以及tau蛋白的磷酸化水平均显著升高。研究结论:褪黑素可显著上调miR-504-3p的表达水平,促进miR-504-3p靶向p39 3’UTR,降低p39的表达水平,进而降低Cdk5活性,从而降低Cdk5激酶相关tau蛋白的磷酸化水平,并减少神经原纤维缠结的形成。
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