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本实验利用Tet-on真核表达系统，尝试以Clontech公司的PTRE-Tight和PTRE-Tight-Luc载体为基础，将反式蛋白rtTA表达框和低背景响应元件Ptight组装到同一个载体上，成为“二合一”的pTRE-Tight-rtTA，用EGFP和Luciferase两种报告基因代替目的基因，构建单质粒（pTRE-Tight-rtTA-EGFP和pTRE-Tight-rtTA-Luc）模式的四环素诱导表达调控系统。方法：（1）单载体pTRE-Tight-rtTA-EGFP和pTRE-Tight-rtTA-Luc的构建：从pTet-On Advanced载体上克隆出rtTA基因，将其亚克隆入pTRE-Tight载体中，获得重组质粒pTER-Tight-rtTA；从pEGFP-N1载体上克隆出EGFP基因，亚克隆入pTRE-Tight-rtTA载体中，获得单质粒pTER-Tight-rtTA-EGFP。将rtTA基因亚克隆入pTRE-Tight-Luc载体中，获得重组质粒pTRE-Tight-rtTA-Luc。（2）细胞水平验证：用上述单载体分别转染转染猪肾PK15细胞，转染24h后分别用不同浓度的强力霉素（Dox）对两种单载体进行诱导。诱导48h后，在荧光倒置显微镜下，检测pTRE-Tight-rtTA-EGFP中绿色荧光蛋白的表达；用荧光计检测pTRE-Tight-rtTA-Luc中荧光素酶的表达。（3）转基因动物水平验证：将上述单载体分别用SCaI酶切、回收，然后将获得的线性化DNA片段，通过原核显微注射技术将其注入昆明小白鼠受精卵的雄原核中来制备转基因小鼠；然后提取鼠尾基因组DNA，进行PCR和Southern Blot检测，转基因阳性小鼠用Dox（5mg/mL）进行诱导；之后提取鼠尾组织蛋白并测定其浓度，荧光计检测Luc诱导前后的表达。结果：（1）单载体构建中，pTRE-Tight-rtTA-EGFP用EcoR I酶切出现了2343bp和2972bp两条带，pTRE-Tight-rtTA-Luc用EcoR I酶切出现了2804bp和3425bp两条带，与预期结果相符。（2）细胞验证中，pTRE-Tight-rtTA-EGFP在Dox诱导前无或很少有绿色荧光蛋白的表达，Dox诱导后，明显有绿色荧光蛋白的表达；在等摩尔转染条件下，pTRE-Tight-rtTA-Luc的诱导效率明显高于双载体系统，（Dox-1000ng，10倍；Dox-10000ng，8倍）。（3）转基因小鼠制备中，共移植900枚受精卵，移植到25只假孕母鼠输卵管内，10只受体怀孕，最终获得24只成年小鼠。通过PCR和Southern blot二级筛选法获得1只基因组中整合有pTRE、rtTA、Luc的首建转基因鼠。即获得1只阳性转基因小鼠。该转基因小鼠F1代PCR检测表明，其携带的外源基因均具有遗传性；Dox诱导前后，Luc基因的表达增加了2倍左右。结论：(1)成功构建出pTRE-Tight-rtTA-EGFP和PTRE-Tight-rtTA-Luc两种单载体，为进一步在细胞、动物水平验证奠定了基础。(2)在猪肾PK15细胞系中成功建立上述单质粒模式的四环素表达调控系统，经Dox的诱导，通过比较诱导前后两种报告基因的表达情况，验证了该单质粒模式的四环素表达调控系统的严密性和有效性。(3)获得一只携带有单质粒PTRE-Tight-rtTA-Luc基因的首建鼠，通过Dox诱导前后的比较，进一步验证了该单载体系统的可行性和有效性。通过本试验载体的构建，证明该单载体系统无论是在诱导效率还是操作简便性上，均优于目前的双载体系统；为研究四环素调控系统调控下表达任何基因提供了一个很好的技术平台。