研究背景：创伤及骨病所导致的关节软骨损伤在临床工作中十分常见，目前临床修复软骨损伤的方法很多，但都有不同程度的局限性，广为应用的以微骨折术为代表的骨膜刺激术通过破坏钙化软骨层结构，使位于软骨下骨骨髓内的间充质干细胞伴随着血液移行至软骨缺损区，形成血凝块，而干细胞在其中增殖分化形成纤维软骨。然而纤维软骨的生物学特性及机械性能与透明软骨存在显著差异，长期疗效欠佳。而软骨移植技术被认为是拆东墙补西墙的手术方法，易造成供体区病损，且因供区有限，大块软骨缺损难以应用此法。异体软骨移植同样存在着供体获得困难、易造成疾病传播及免疫排斥反应等劣势。软骨细胞移植技术由于细胞获取困难、病人经历二次手术及供体部位软骨损害等因素，通常难以令人满意。以再生医学为主要代表的组织工程技术为治疗关节骨软骨损伤提供新途径和希望，作为其核心内容之一的支架材料在组织工程再生修复中起重要作用。目前应用于组织工程的生物材料及人工材料较为广泛，其中组织工程骨软骨支架因双侧不同的材料需求，所以其制备支架的标准要求较高，制备方式主要包括分层构建和一体化构建两种形式，分层构建即分别构建软骨和骨支架，用纤维蛋白胶粘合或可吸收材料缝合成一个整体，经体外培养或直接植入体内修复缺损；一体化构建即前期制备骨和软骨复合支架，然后分别接种成骨细胞和软骨细胞，体外培养后植入骨软骨缺损处。研究表明工程化组织存在力学性能低下、纤维软骨样退变、与宿主组织整合欠佳等缺点，难以确保关节骨软骨损伤再生修复的长期有效性。依据组织工程学最基本原理及骨软骨组织工程技术最新进展，认为导致上述问题的主要原因为：①对关节骨软骨组织独特的生化成分、形态结构及其力学与生物学功能缺乏深入认识；②现有策略构建的工程化骨软骨在结构与功能上存在明显缺陷，尤其是缺少透明软骨与软骨下骨之间的界面连接结构---钙化软骨层；其中，缺乏对关节骨软骨界面连接结构的深入认识与仿生构建理念是其最重要的原因和限制这一技术临床应用的瓶颈。据此，在深入认识关节骨软骨钙化软骨层的形态结构与理化功能的基础上，根据工程化“透明软骨—钙化软骨层—软骨下骨”一体化构建新理念，我们选用脱细胞和复合胶原冻干交联的方法设计制造具有“钙化层结构”的天然骨软骨支架。以Ⅱ型胶原凝胶构建软骨部分，保留天然钙化层结构的骨块经脱细胞处理后构建骨部分。将二者复合冻干、交联，保留了骨软骨天然的细胞外基质成分，因而生物相容性佳；支架分别采用骨和软骨组织中的的细胞外基质成分为原料进行构建，适合两种组织不同的生长需求；本研究保留天然钙化层结构，更符合骨软骨生理特征，因此可能成为骨软骨组织工程的理想支架。本课题阐明了“钙化软骨层”结构在骨软骨复合组织中构建的可行性，为应用新理念再生修复关节骨软骨缺损提供理论依据和技术支持。方法：1.保留天然钙化软骨层结构脱细胞骨的制备及鉴定：钻取直径8mm的含有天然钙化软骨层结构的骨柱，尽可能切除上层软骨而确保不伤及钙化层结构。对骨柱进行脱细胞处理，然后进行组织学检测脱细胞情况及脱细胞过程对钙化层的影响。2. Ⅱ型胶原蛋白的制备及鉴定：取新鲜猪膝关节，分离各关节面，削取软骨片，冻干、粉碎、消化制备Ⅱ型胶原蛋白。检测其提取率、分子量、纯度等指标。3.复合骨软骨支架的研制及鉴定：将脱细胞骨块放入模具上方接种2mm厚的Ⅱ型胶原蛋白，冻干、交联制备骨软骨支架，扫描电镜及无水乙醇置换法对支架结构孔径孔隙进行测量。以无钙化层的骨软骨支架为对照组，接种BMSCs观察其细胞相容性。慢病毒eGFP转染BMSCs接种支架，观察细胞生长情况。4.使用SigmaPlot12.0进行绘图制表，SPSS18.0对骨软骨支架的孔径孔隙率进行数据分析，数值以x±s表示。结果：1.保留天然钙化软骨层结构脱细胞骨的制备及鉴定：含有钙化软骨层骨支架脱细胞效果良好，组织学观察细胞清除彻底，组织学观察结合Micro-CT可见钙化软骨层与软骨下骨结构与正常骨软骨比较完整无破坏。2. Ⅱ型胶原蛋白的制备及鉴定：制备的Ⅱ型胶原蛋白呈乳白色凝胶状，Ⅱ型胶原蛋白提取率为3.9%，SDS-PAGE监测结果提示分子量略大于130KD，无杂带。高效液相色谱与Sigma公司生产的Ⅱ型胶原蛋白对比主峰出现部位基本相同。3.复合骨软骨支架的研制及鉴定：实验组及对照组支架制备完成，骨软骨连接良好，支架具有良好的孔径孔隙率，软骨部分的Ⅱ型胶原海绵支架的孔隙率为（91.1±3.8）%，其孔径大小为（79.7±17.1）μm；脱细胞骨支架的孔隙率为（73.5±2.6）%，其孔径大小为（470.2±158.8）μm。BMSCs接种至支架复合培养，生长及粘附良好，可满足细胞生长要求。结论：采用保留钙化层骨块脱细胞结合Ⅱ型胶原蛋白冻干交联方法，成功制备出具有三层结构的骨软骨支架。该支架保留了天然的钙化软骨层和软骨下骨结构，软骨和软骨下骨支架具有适宜的孔径孔隙率，可满足细胞的生长要求。SD大鼠BMSCs与支架共培养实验证实该支架具有良好的生物相容性，但尚需进行动物实验验证仿生型骨软骨支架的生物学功能。