Lj-RGD3是来自于日本七鳃鳗口腔腺的分泌蛋白，由118个氨基酸残基组成，因含有3个RGD(精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)模体而得名。除此之外，Lj-RGD3还含有一对半胱氨酸和17个组氨酸。rLj-RGD3是本课题组前期通过基因克隆手段获得的带有组氨酸（His）纯化标签的Lj-RGD3基因重组蛋白，为一带有质粒上6个His的融合蛋白。大量实验结果表明，rLj-RGD3蛋白具有抗血管新生，抗肿瘤细胞迁移，浸润等功能，有望成为抗血栓及抗肿瘤新药，本课题组正在对其进行抗肿瘤、抗血栓临床前研究。本研究目的：rLj-RGD3(H-)是在rLj-RGD3蛋白基础上去除His纯化标签的基因重组蛋白，其所含序列与Lj-RGD3基因推导序列完全相同。根据《中华人民共和国药典》关于基因重组蛋白药物的要求，所使用的基因重组蛋白中不得含有融合的纯化标签，故本研究的目的就是通过分子克隆手段将rLj-RGD3上的His标签去除掉，以获得不带任何纯化标签的rLj-RGD3(H-)，并对其进行蛋白发酵及纯化的中试工艺研究。研究方法：利用分子克隆方法在Lj-RGD3基因后加入终止密码子，再构建回原pET23b载体，使重组质粒上的His标签不表达。利用氯化钙转化方法将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中以终浓度1mM的IPTG低温过夜诱导表达，并将该蛋白命名为rLj-RGD3(H-)。本课题利用20L、90L不同规格的发酵罐进行菌体高密度发酵条件摸索，利用BIO-RAD和AKTA蛋白纯化系统，采用GE公司的亲和层析柱HisTrap·HP(Ni2+柱)、Talon(Co2+柱)、HiTrap IMAC(Cu2+柱)；阳离子交换层析柱（SP FF柱、SP HP柱）；疏水层析HiTrap Phenyl HP、Phenyl FF LS、HitrapButyl FF柱；肝素亲和层析柱进行蛋白纯化工艺研究。在制剂研究中，通过添加山梨醇、氯化钠、甘氨酸、维C等不同稳定剂或抗氧化剂等药物敷料，来进行药物制剂配方优化的初步研究。并对初步优化的rLj-RGD3(H-)进行生物学功能验证。研究结果：本课题利用分子生物学方法成功构建了pET23b-RGD3(H-)重组载体，并获得了蛋白的可溶性表达。高密度发酵实验结果表明，20L的发酵罐可生产出2.76kg菌体。纯化工艺采用组氨酸亲和层析、SP柱离子交换层析，疏水层析三步完成。同时，在纯化的蛋白中加入维C、山梨醇、甘氨酸、氯化钠等保护剂，经SDS-PAGE检测，这些保护剂对纯化蛋白都有很好的稳定和保护作用。关于其功能的实验表明其同样具有抗血管新生功能、抗血栓形成功能。结论：本课题完成了去纯化标签rLj-RGD3(H-)蛋白的基因克隆与表达、发酵及纯化工艺优化，并对其制剂处方进行了初步研究,并证明其具有抗血栓及血管新生活性。随着课题的深入，将完成rLj-RGD3(H-)的药学研究，为利用其进行抗血栓、抗肿瘤的临床前研究及IND申报提供实验数据和受试药品。