论文部分内容阅读
目的:脐带间充质干细胞来源的外泌体（MSC-EVs）对肺纤维化（PF）的治疗作用及可能涉及到的相关机制的探究。方法:（1）外泌体的分离及鉴定:收集西安市中心医院妇产科正常分娩的新生儿脐带组织,于无菌操作台上剪碎后用干细胞专用培养基培养。当细胞汇集达70%-80%时,进行一次传代。当传至第五代时,收集细胞上清。先经300×g及2000×g分别离心10分钟,然后用10000×g离心机离心30分钟,最后将超速离心机设置为100,000×g离心70分钟,再用无机磷酸盐缓冲液（PBS）重悬,获得外泌体悬液。用透射式电子显微镜检测收集到的颗粒,再用纳米粒子跟踪分析检测到的颗粒的大小。最后用免疫印迹法（Western Blot）对其表面抗原（Calnexin,CD9）进行鉴定。（2）体内肺间质纤维化模型的建立。实验动物选取45只雄性成年C57BL/6小鼠,周龄在8到12周,体重约20±2g。诱导药物选取博来霉素（BLM）。采取气管插管及气管内滴注法进行给药。将45只C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham组）,BLM+PBS组及BLM+MSC-EVs组。用4%水合氯醛（10m L/kg）腹腔注射麻醉小鼠后,根据小鼠体重向BLM+PBS组和BLM+MSC-EVs组小鼠肺内滴注BLM（5U/kg）。给药3小时后再次以气管插管方式向BLM+MSC-EVs组小鼠肺内滴注50μg MSC-EVs（50μl PBS稀释）,同时给予BLM+PBS组小鼠气管内滴注等体积PBS。分别于给药7天、14天、28天后处死小鼠,取肺组织以进行后续实验。（3）取以上三组小鼠部分肺组织进行HE染色和Masson染色,以观察小鼠肺部病变情况。根据上述染色结果,选取给药后第28天三组小鼠的肺组织进行m RNA测序,通过对测序结果进行KEGG富集分析和GO富集分析来判断BLM诱导体内PF可能涉及的生物学过程及相关信号通路。（4）体外水平验证MSC-EVs对PF的作用及相关机制。选取A549细胞利用TGF-β1建立体外肺纤维化模型。将细胞随机分为control组、control+MSC-EVs组、control+TGF-β1组及TGF-β1+MSC-EVs组。将各组细胞均匀铺至六孔板中,加入无血清培养基饥饿24小时以达到同步化后,弃去原培养基。用不含胎牛血清（FBS）的培养基稀释TGF-β1至终浓度为10ng/ml,培养24小时以诱导control+TGF-β1组、TGF-β1+MSC-EVs组的A549细胞发生纤维化,其他组加入等浓度的PBS培养24小时。诱导纤维化完成后,弃去原培养基,收集control组、control+TGF-β1组细胞。向control+MSC-EVs组、TGF-β1+MSC-EVs组加入用无血清培养基稀释后的外泌体（10μg/ml）诱导12h,收集细胞。用Western Blot法检测胶原沉积相关分子（collagen I、α-SMA）、氧化应激相关分子（Nrf2、HO-1）及炎症相关分子（NF-κB p65、IL-2、IL-1β）的表达。（5）根据m RNA测序及分析结果,选取给药后14天、28天小鼠部分肺组织进行免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）及Western Blot,从多角度验证MSC-EVs对PF的治疗作用及相关机制。结果:（1）在透射电子显微镜下观察到通过培养MSC进而分离出的外来体的形状为椭圆形囊泡,直径约50-200nm。Western Blot结果显示:MSC组仅表达Calnexin,而MSC-EVs组则仅表达CD9。（2）体内PF结果表明,MSC-EVs可缓解BLM诱导的小鼠肺组织炎细胞浸润、肺泡塌陷或结构消失、肺泡周围严重充血,且在给药28天后最明显。（3）以差异倍数（FC）绝对值≥2、P＜0.05为筛选差异表达基因的基本标准。在Sham组和BLM+PBS组之间筛选出上调基因133个,下调基因124个。GO富集分析结果表明:BLM诱导小鼠发生PF时主要涉及分子功能和细胞成分。分子功能学主要涉及细胞外基质结构成分和免疫反应,而细胞成分方面主要富集在胶原蛋白集聚方面。而KEGG通路富集分析表明,BLM可能主要通过调控上皮间质转化信号通路、蛋白质消化吸收、免疫炎症机制信号通路诱导体内PF。（4）体外Western Blot结果表明,MSC-EVs对正常细胞无刺激作用,但可调控TGF-β1诱导的A549细胞collagen I、α-SMA、Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IL-2、IL-1β的表达。（5）体内IHC染色、Western Blot结果表明:MSC-EVs可缓解BLM诱导的小鼠肺组织collagen I、α-SMA、Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IL-2、IL-1β的表达。结论:（1）经过培养MSC进而分离出的物质为外泌体,可用于后续实验研究。（2）MSC-EVs可缓解小鼠肺纤维化。（3）肺纤维化的发生主要涉及分子功能和细胞成分,可能涉及胶原沉积、核受体相关蛋白、免疫调节等相关机制。（4）MSC-EVs可能通过减少细胞外基质沉积、抑制氧化应激及免疫炎症反应来治疗PF。