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背景和目的:在产科临床中,产后出血是常见的并发症之一,可引起子宫内膜中度至重度缺血性损伤。而子宫内膜缺血后常伴有再灌注,可导致人子宫内膜细胞明显氧化损伤。在分子水平上,缺血再灌注会引起活性氧簇(ROS)的产生和子宫内膜细胞的过度氧化损伤,导致循环脂质过氧化物的产生和各种抗氧化剂的减少。这些因素将会引起进一步的DNA断裂、蛋白损伤和线粒体功能障碍,最终导致子宫内膜细胞和组织死亡。研究证实亲环蛋白D(Cyp D)依赖性程序性坏死通路介导OGDR对人子宫内膜细胞的细胞毒作用。在体外实验中,常利用氧葡萄糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)和随后的复氧(reoxygenation,OGDR)作用于培养的子宫内膜细胞模型,以模拟机体缺血再灌注和氧化损伤。micro RNAs(mi RNAs)是长约22核苷酸(nt)的内源性非编码RNA(nc RNAs)。mi RNA被证实广泛参与人体各种疾病的发生发展。mi RNAs可以通过直接与3’-非翻译区(3’-UTR)结合来抑制靶向m RNA的翻译和/或表达。在本论文中我们将阐述一种新的鉴定的Cyp D靶向mi RNA,micro RNA-1203(mi R-1203),我们的结果表明mi R-1203靶向并沉默Cyp D以保护人子宫内膜细胞免受OGDR诱导的程序性坏死。研究方法和内容:通过三种生物信息预测软件(Targetscan,mi Rbase和mi RDB)预测,验证mi R-1203和Cyp D 3’-UTR结合位点,人子宫内膜细胞系T-HESC荧光素酶报告基因验证转染野生型(WT)或两个突变体(Mut1/2)mi R-1203模拟物与Cyp D3’-UTR结合;体外构建pre-mi R-1203慢病毒过表达和干扰载体(lv-pre-mi R-1203/lv-mi RC和lv-antago mi R-1203/anta C),转染T-HESC和人原代子宫内膜细胞,实时定量聚合酶链反应(q PCR)验证mi R-1203和Cyp D m RNA的表达水平,Western blotting检测Cyp D的蛋白表达变化;分别OGDR诱导后上述稳定mi R-1203过表达和抑制的T-HESC细胞株和人原代子宫内膜细胞后,使用荧光染料DCFH-DA(2’,7’-二氯荧光素乙酸盐)流式细胞术测定ROS水平,JC-1绿色荧光探针检测线粒体去极化,CCK-8(cell counting kit-8)检测细胞活力,Western blotting检测胞浆中细胞色素C的释放,试剂盒检测培养基中LDH的释放。同时在T-HESC细胞株中OGDR不同时间点处理(6h,12h,18h,24h),检测mi R-1203和Cyp D m RNA的表达水平;使用ROS清除剂NAC(N-acetylcysteine,500μM,1h)预处理T-HESC细胞以及在lv-antago mi R-1203感染的人原代子宫内膜细胞中加入Cyp D阻断剂Cs A后,CCK-8检测细胞活力和培养基LDH释放检测细胞坏死改变;使用CRISPR/Cas9技术完全敲除T-HESC细胞中Cyp D(Cyp D-KO)后分别过表达或抑制mi R-1203表达以及构建UTR-depleted Cyp D载体(UTR-null Cyp D)转染mi R-1203过表达T-HESC细胞,OGDR处理24h后,CCK-8检测细胞活力改变,LDH释放检测细胞坏死,同时q PCR检测mi R-1203表达,Western blotting检测Cyp D蛋白表达;在人原代子宫内膜细胞中,过表达以及抑制mi R-1203表达后,Cyp D抑制剂Cs A预处理,OGDR 24h诱导,LDH释放检测细胞坏死,q PCR检测mi R-1203表达。研究结果:通过生信预测以及荧光素酶报告基因,我们发现mi R-1203靶向Cyp D的3’-UTR(位置为806-813),T-HESC细胞株和人原代子宫内膜细胞过表达mi R-1203显著抑制Cyp D的m RNA和蛋白表达水平。相反,抑制mi R-1203能明显提高Cyp D表达水平。mi R-1203在子宫内膜细胞中的过表达减轻了OGDR诱导的程序性坏死,抑制了线粒体Cyp D-p53-ANT1(Adenine nucleotide translocator)的关联,线粒体去极化,活性氧的产生和乳酸脱氢酶的释放。相反,OGDR诱导的程序性坏死和细胞毒性随着子宫内膜细胞中mi R-1203的抑制而增强。此外,mi R-1203过表达或抑制未能改变OGDR诱导的Cyp D敲除或抑制的T-HESC细胞毒性。最后当转染UTR缺失的Cyp D过表达载体后,同时mi R-1203的过表达并不能保护OGDR诱导的细胞损伤作用。结论:以上研究结果表明mi R-1203通过靶向并沉默Cyp D以保护人子宫内膜细胞免受OGDR的损伤,外源驱动mi R-1203-Cyp D级联可能是一种保护人子宫内膜细胞免受OGDR侵袭的新策略。