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第一部分miR-133b在大鼠脊髓损伤后脊髓组织中表达变化目的:研究miR-133b在大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓组织中表达情况。方法:选48只成年雄性SD大鼠,随机分为以下8个实验组:正常组、脊髓损伤后12小时组、脊髓损伤后24小时组,脊髓损伤后48小时组,脊髓损伤后72小时组,脊髓损伤后96小时组,脊髓损伤后5天组和脊髓损伤后1周组。每个实验组各6只大鼠。通过动脉瘤夹夹闭大鼠T10脊髓10s,从而建立实验性脊髓损伤动物模型。模型建立后的12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、5天、1周分别将各组大鼠处死,取出大鼠T10节段脊髓组织做标本,用荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)等方法,检测脊髓组织中miR-133b表达水平的变化情况,并进行统计学分析。结果:PCR结果显示:miR-133b在SCI组与假手术组中均有表达。SCI组中miR-133b在损伤后12h时表达水平即出现下降,与假手术相比较,miR-133b在24h后表达水平有显著降低(p<0.05),并随时间推移呈下降趋势。结论:1.miR-133b在正常大鼠脊髓组织及损伤后脊髓中均有表达。2.miR-133b在大鼠脊髓损伤后一周内表达水平呈下降趋势,在脊髓损伤后24小时miR-133b表达量已出现显著差异。第二部分miR-133b在骨髓间充质干细胞来源的外泌体中的表达情况目的:研究miR-133b在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的外泌体中的表达情况。方法:1.构建过表达miR-133b的质粒及其对照质粒:提取及培养大鼠原代MSCs,miR-133b质粒及对照质粒转染MSCs并建立稳定表达miR-133b的MSCs和对照组MSCs。2.分离和鉴定MSCs来源的外泌体:离心机分离MSCs来源外泌体,Western blot法鉴定外泌体蛋白标志物(CD9,CD63和CD81),提取外泌体中的RNA并采用Real-time PCR方法鉴定miR-133b表达量。结果:PCR结果显示:miR-133b在转染后的MSCs中持续表达,与对照组质粒相比表达量有显著差异(p<0.01)。miR-133b在外泌体中显著表达,与对照组相比有显著差异(p<0.01)。Western blot结果显示:离心后的混悬液中含有大量外泌体,外泌体标志蛋白CD9,CD63和CD81表均有表达。结论:1.MSCs来源的混悬液中含有外泌体。2.转染后MSCs分泌的外泌体大量表达miR-133b。第三部分miR-133b修饰的MSCs来源外泌体对大鼠脊髓损后神经功能恢复作用的研究目的:建立大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)模型,研究miR-133b在对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的作用。方法:选30只成年雄性SD大鼠,随机分为以下5个实验组:假手术组、对照组、PBS对照组,miR对照组,miR-133b干预组,每个实验组各6只大鼠。通过动脉瘤夹夹闭大鼠T10脊髓l0s,从而建立实验性脊髓损伤动物模型。模型建立后的24小时采用尾静脉注射法分别使用PBS、miR-control、miR-133b干预,SCI后第四天分别将各组大鼠处死,取出大鼠T10节段脊髓组织做标本,用Real-time PCR方法检测脊髓中miR-133b表达量。Western blot法检测靶基因RhoA表达,通过Western blot方法测定p-ERKl/2,ERK1/2,p-STAT3,STAT3,p-CREB 和CREB的表达,了解miR-133b对轴突再生相关通路的影响。Western blot方法及免疫荧光方法测定NF(神经丝蛋白)、GAP43(生长相关蛋白43)、MBP(髓鞘碱性蛋白)、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)等多种蛋白的表达,明确miR-13 3b对神经功能恢复的影响。结果:PCR结果显示:miR-133b表达control组与sham组相比,表达显著降低(p<0.001);PBS组与control组相比,miR-133b表达无明显统计学差异(p>0.05);miR-con组较PBS组相比miR-133b表达有升高趋势,但结果无统计学意义(p>0.05);miR-133b 与 miR-con 相比,miR-133b 表达显著增加(p<0.001)。Western blot 结果显示:RhoA表达:miR-con组较control组有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05),miR-133b组与miR-con组相比有明显下降(P<0.05)。miR-con组p-ERK1/2/ERK1/2水平较control组相比无统计学差异(P>0.05),miR-133b组较miR-con组有明显差异(P<0.05)。miR-con 组 p-CREB/CREB 水平较 control 组相比无统计学差异(P>0.05),miR-133b组较 miR-con 组有明显差异(P<0.01)。miR-con 组 p-STAT3/STAT3 水平较 control组相比无统计学差异(P>0.05),miR-133b组较miR-con组有明显差异(P<0.05)。miR-con组NF表达较control组相比无统计学差异(P>0.05),miR-133b组较miR-con组有明显差异(P<0.05)。miR-con组GAP-43表达较control组相比明显升高(P<0.05),miR-133b 组较 miR-con 组亦有明显差异(P<0.05)。miR-con 组 GFAP 表达较 control组相比明显升高(P<0.05),miR-133b组较miR-con组亦有明显差异(P<0.01)。MBP在miR-con组表达较control组相比明显升高(P<0.05),miR-133b组较miR-con组有显著差异(P<0.01)。结论:1.注射miR-133b修饰的MSCs来源外泌体后,miR-133b在SCI大鼠脊髓组织显著表达。2.miR-133b影响轴突再生相关通路,增加NF、GAP-43、GFAP、MBP的表达。3.miR-133b修饰的MSCs来源外泌体促进SCI大鼠神经功能的恢复。