母婴分离（Maternal Separation,MS）是描述哺乳动物生命早期遭受不良应激刺激的经典早年应激模型,可导致成年后认知障碍和情绪异常。氨基酸是重要的生命活性物质,研究表明母婴分离应激可导致机体代谢震荡,其中氨基酸及其代谢发生变化可能与机体认知障碍密切相关,但结果尚无定论。近年来利用代谢组学技术已在罹患不同疾病的患者体内分析筛选出具有潜在生物学特性的代谢物,为疾病研究、诊断和治疗提供干预手段。亮氨酸作为必须氨基酸可迅速透过血脑屏障进入中枢神经系统,在神经元的生存调控中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。本研究通过代谢组学技术分析和筛选出母婴分离应激大鼠血清和脑脊液中可能参与认知调控的氨基酸,并探索关键氨基酸变化（亮氨酸）在认知障碍中的生物学作用,从神经元自噬的角度出发,揭示了亮氨酸缺乏对神经元自噬的调控机制,为阐明母婴分离应激致认知障碍发生的分子机制提供新的理论依据,为改善该类应激人群的精神健康状态提供新的治疗思路。一、母婴分离应激致大鼠认知障碍的氨基酸组学研究为了观察MS应激对雌、雄大鼠认知功能的影响,从代谢组学角度探索外周血清及中枢脑脊液氨基酸在MS应激影响下的差异,筛选出具有一定生物学意义的氨基酸,并通过分子生物学实验进行验证。使用MS方法建立雌、雄大鼠早年应激模型。采用Open-field旷场实验评估大鼠陌生环境自主探索能力,物体识别实验评估动物对新旧物体的记忆能力,Morris水迷宫实验评估动物空间学习和记忆能力。采用超高效液相色谱-串联质谱联用仪（UPLC-MS/MS）和代谢组学检测和筛选血清及脑脊液内氨基酸。采用LDH快速检测试剂盒和流式细胞术检测氨基酸干预GC诱导的神经元损伤模型的LDH释放量和细胞凋亡率。结果显示MS应激的雌、雄大鼠在空间自主探究能力、记忆能力及空间学习记忆功能较CON组均下降,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）,MS应激雌性大鼠认知能力评分略高于雄性大鼠;尼氏染色显示雄性MS大鼠海马CA1、CA3区,雌性MS大鼠海马CA3区神经元较CON组减少,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）,神经细胞排列疏松,染色较浅,其余区域神经元数量变化及排布未见显著差异;Elisa法检测血清和脑脊液GC和NE含量,GC含量升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,NE水平变化无差异。对血清和脑脊液氨基酸绝对定量,根据定量结果建立数学模型,PLS-DA和OPLS-DA结果显示MS应激雌、雄大鼠血清和脑脊液氨基酸谱差异显著,综合定量数据在整体数据模型中的变量投影重要度（VIP＞1.0）、代谢物的可靠度（Corr.Coeffs）、单维检验分析|log2F|＞0得到雌性大鼠血清中犬尿氨酸和脑脊液中苏氨酸为具有潜在生物学特性的氨基酸;对VIP及Corr.Coeffs进行排序,筛选出雌、雄MS大鼠脑脊液中赖氨酸、亮氨酸、5-羟赖氨酸、天冬氨酸4种氨基酸在多组排序中重合度高;细胞学实验确定100μmol/L GC为神经元体外应激损伤模型的实验浓度,叠加4种氨基酸的不同浓度梯度,发现亮氨酸在10μmol/L以上、其余三种氨基酸在100μmol/L以上浓度时,与100μmol/L GC组相比,LDH释放量及细胞凋亡率较降低,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。二、亮氨酸在母婴分离应激致大鼠认知障碍中的生物学作用为观察不同含量亮氨酸饮食对MS应激大鼠认知功能的调控作用以自噬和凋亡的发生为切入点,探讨亮氨酸在MS应激致认知障碍中发挥的主要生物学效应。对雌、雄大鼠进行实验分组:对照正常饮食组（CON+N）,对照低亮氨酸饮食组（CON+L-LEU）,MS应激正常饮食组（MS+N）,MS应激低亮氨酸饮食组（MS+L-LEU）,MS应激高亮氨酸饮食组（MS+H-LEU）;对动物进行认知行为学检测:同第一章。采用酶标记免疫吸附测定实验法（ELISA）检测脑脊液亮氨酸水平。采用透射电镜检测大鼠海马自噬体。采用Tunel免疫荧光染色检测大鼠海马凋亡发生。采用全自动蛋白质印迹定量分析系统（WES）检测自噬及凋亡相关蛋白Beclin-1、Bcl-2、Bax表达。结果显示雌、雄大鼠正常低亮氨酸饮食组、MS应激正常饮食组、MS应激低亮氨酸饮食组较正常生长饮食组脑脊液亮氨酸含量降低,MS应激高亮氨酸饮食组较MS应激低亮氨酸饮食组升高,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。对照低亮氨酸饮食组、MS应激正常饮食组、MS应激低亮氨酸饮食组、MS应激高亮氨酸饮食组雌、雄大鼠旷场评分和物体识别指数较对照正常饮食组降低,雄性MS应激高亮氨酸饮食组旷场评分和物体识别指数较MS应激低亮氨酸饮食组升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,雌性MS高亮氨酸饮食组较MS低亮氨酸饮食组旷场评分和物体识别指数升高,差异无统计学意义;Morris水迷宫实验中,MS正常饮食组和MS低亮氨酸饮食组雌、雄大鼠穿台次数较对照正常饮食组减少,差异有统计学意义（P＜0.01）。MS高亮氨酸饮食组穿台次数较MS低亮氨酸饮食组增加,差异无统计学意义。对照低亮氨酸饮食组、MS正常饮食组、MS低亮氨酸饮食组、MS高亮氨酸饮食组雄性大鼠和MS低亮氨酸饮食组雌性大鼠潜伏时间较对照正常饮食增加,MS高亮氨酸饮食组雌、雄大鼠潜伏时间较MS低亮氨酸组减少,差异有统计学意义（P＜0.01）。电镜发现雄性对照低亮氨酸饮食组和MS低亮氨酸饮食组大鼠海马存在自噬小体,正常生长饮食组、MS高亮氨酸饮食组未发现自噬体,不同剂量亮氨酸饮食雌性大鼠各组海马均未发现自噬体。Tunel荧光检测各组大鼠海马内未见凋亡发生。检测大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1,雄性大鼠MS正常饮食组、MS低亮氨酸饮食组表达增加,MS高亮氨酸饮食组比MS低亮氨酸饮食组降低,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）,雌性大鼠各组Beclin-1表达变化无统计学意义。检测大鼠海马凋亡相关蛋白BCL-2、Bax表达,正常低亮氨酸饮食组、MS正常饮食组、MS低亮氨酸饮食组BCL-2/Bax比值下降,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。三、亮氨酸缺乏介导认知障碍的调控机制为观察亮氨酸缺乏对神经元自噬的影响,验证亮氨酸缺乏介导的神经元过度自噬引发的损伤效应可能是MS应激致海马神经元数量减少最终造成认知障碍的重要原因。建立细胞模型:对照组神经元标准培养基培养（CON+N）,对照组神经元亮氨酸缺乏培养基培养（CON+NOLEU）,GC干预神经元标准培养基培养（GC+N）,GC干预神经元亮氨酸缺乏培养基培养（GC+NOLEU）,自噬抑制剂（巴弗洛霉素A1）诱导神经元亮氨酸缺乏培养基培养（NOLEU+B-A1）,自噬抑制剂诱导神经元标准培养基培养（CON+B-A1）。采用全自动蛋白质印迹定量分析系统（WES）检测Beclin-1和LC3II/I水平自噬流。采用免疫荧光（IF）检测荧光双标m RFP-GFP-LC3慢病毒感染神经元LC3的表达。采用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST检测试剂检测LDH释放量。采用流式细胞术（Annexin-V与PI双染试剂盒）检测神经元凋亡率。结果显示:Beclin-1和LC3II和LC3I蛋白表达水平并计算LC3II/I比值,100μmol/L GC诱导神经元较CON组升高,GC+NOLEU较GC+N升高,GC+不同浓度亮氨酸较GC+NOLEU降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;自噬双标慢病毒m RFP-GFP-LC3感染各组神经元,CON+NOLEU组Red+Green荧光强度增加,其余各组荧光强度降低,确定神经元自噬流增加。自噬双标慢病毒m RFP-GFP-LC3感染各组神经元,GC+NOLEU组荧光强度增加,其余组荧光强度随浓度升高而减弱。亮氨酸缺乏培养基培养神经元时检测CON+NOLEU组LC3II/I较CON+N升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。CON+不同梯度亮氨酸组LC3II/I较CON+NOLEU组降低,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。NOLEU、NOLEU+B-A1组LDH释放量较CON组升高,NOLEU+B-A1组和CON+B-A1组LDH释放量较NOLEU组降低,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。NOLEU组较CON组细胞凋亡率升高,NOLEU+B-A1、CON+B-A1组较NOLEU组细胞凋亡率降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。综上所述:MS应激致大鼠认知功能损伤,雌性损伤程度轻于雄性,可能与海马区神经元病理损伤程度有关。MS应激引起中枢和外周氨基酸代谢紊乱,应激所致雌雄认知功能损伤差别可能与犬尿氨酸和苏氨酸代谢有关。赖氨酸、亮氨酸、5-羟赖氨酸和天冬氨酸代谢异常可能是MS应激致认知障碍的重要介导因素或分子基础,其中亮氨酸是关键功能氨基酸。低亮氨酸饮食可以加剧MS应激所致认知功能障碍,补充亮氨酸可改善应激性认知损伤程度。MS应激和低亮氨酸饮食可诱导雄性大鼠海马自噬激活并存在凋亡发生的趋势。亮氨酸缺乏诱导神经元自噬过度激活,引起细胞凋亡,造成神经元损伤,补充亮氨酸可缓解损伤效应。自噬异常可能是亮氨酸介导MS应激致认知障碍的重要病理机制。