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目的细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2）信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的重要组成部分,在细胞生存、凋亡、炎症反应以及应激损伤等多种生物学过程中扮演着重要的调控角色。然而,ERK1/2信号通路在衰老心肌缺血损伤中的变化及其调节作用还不清楚。因此,本研究首先观察老龄小鼠心肌和衰老心肌细胞缺血/缺氧损伤后ERK1/2信号通路的变化,探讨ERK1/2信号通路变化与心肌损伤的关联性;其次,利用组成性激活MEK1突变基因（constitutively active MEK1,CaMEK）转导干预ERK1/2信号通路后研究该信号通路对老龄小鼠心肌缺血损伤和衰老心肌细胞缺氧损伤的调控作用;最后,从线粒体融合与分裂角度探讨ERK1/2信号通路参与衰老心肌缺血/缺氧损伤调控过程的分子机制。方法本研究在动物和细胞水平开展实验,分为三个部分:（1）第一部分:将年轻（12周-16周龄）和老龄（16月龄）雄性C57BL/6J小鼠分为年轻假手术组、年轻心肌梗死（myocardial infarction,MI）组、老龄假手术组和老龄MI组。MI组小鼠进行结扎左冠状动脉前降支血管处理,而假手术组小鼠不结扎冠状动脉。在小鼠MI后3天或28天检测小鼠心功能、心肌梗死面积、心肌损伤标志物乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和肌酸激酶（creatine kinase,CK）水平,并通过Western blot实验检测心肌组织ERK1/2信号通路关键蛋白表达水平。同时,提取培养新生Sprague-Dawley大鼠原代心肌细胞,分为非衰老对照组、非衰老缺氧组、衰老对照组和衰老缺氧组。衰老心肌细胞模型由20g/L D-半乳糖诱导建立,并通过衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal）染色和衰老标志物检测进行鉴定。细胞缺氧处理由缺氧小室诱导完成。在心肌细胞缺氧24小时后检测细胞活力、LDH水平和ERK1/2信号通路关键蛋白表达。（2）第二部分:将老龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、MI空白对照组、MI+GFP基因转导（MI+GFP）组和MI+CaMEK基因转导（MI+CaMEK）组,MI建模同第一部分,MI+GFP组和MI+CaMEK组小鼠分别在MI建模前5周经尾静脉注射AAV9-CMV-GFP和AAV9-CMV-CaMEK(MOI=1×1011vg/小鼠)进行病毒感染。在小鼠MI后3天或28天,采用超声分析系统评估小鼠心功能,应用相应试剂盒检测血清LDH、CK水平和心肌ATP含量,DHE染色检测心肌组织活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡指数,并通过Western blot实验检测心肌组织ERK1/2信号通路关键分子、线粒体融合与分裂调控蛋白以及凋亡相关蛋白的表达。（3）第三部分:将新生Sprague-Dawley大鼠原代心肌细胞经D-半乳糖诱导为衰老心肌细胞,分为对照组、缺氧组、缺氧+GFP组、缺氧+CaMEK组、缺氧+DMSO组和缺氧+PD98059组。细胞缺氧处理同第一部分。缺氧+GFP组和缺氧+CaMEK组心肌细胞分别予以AAV9-CMV-GFP或AAV9-CMV-CaMEK（MOI=1×107vg/cell）感染5天,再进行缺氧处理。缺氧+PD98059组心肌细胞给予ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059（浓度50μmol/L）处理,直至缺氧处理结束。细胞处理完毕后,采用CCK-8试剂盒、LDH试剂盒和流式细胞术分别检测细胞活力、毒性和凋亡,应用Mito SOX、Mito Tracker和JC-1荧光探针分别检测心肌细胞线粒体ROS水平、形态和膜电位水平,通过Western blot实验检测细胞ERK1/2信号通路、线粒体融合与分裂调控蛋白以及凋亡相关蛋白的表达变化。结果（1）第一部分:（1）小鼠心功能:与同龄假手术组小鼠相比,MI组小鼠在MI建模后3天和28天的左心室短轴缩短率（fractional shortening,FS）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）显著降低,差异有统计学意义（P均<0.05）;与年轻MI组小鼠相比,老龄MI组小鼠在MI建模后3天的FS降低,而在MI建模后28天的FS和LVEF均降低,差异有统计学意义（P均<0.05）。（2）小鼠心肌梗死面积:与年轻MI组小鼠相比,老龄MI组小鼠MI建模后28天的心肌梗死面积明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）小鼠血清LDH和CK水平检测:与同龄假手术组小鼠相比,MI组小鼠血清LDH和CK水平升高,差异有统计学意义（P均<0.05）。与年轻MI组小鼠相比,老龄MI组小鼠血清LDH和CK水平升高,差异有统计学意义（P均<0.05）。（4）心肌细胞衰老鉴定:与非衰老心肌细胞相比,20g/L D-半乳糖诱导48小时使得心机细胞SA-β-Gal染色阳性比例以及p16、p21蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义（P均<0.05）。（5）细胞活力和LDH水平检测:与相应对照组相比,缺氧处理使衰老和非衰老心肌细胞活力降低、LDH水平升高,差异有统计学意义（P均<0.05）;与非衰老缺氧组相比,衰老缺氧组心肌细胞活性降低而LDH水平增高,差异有统计学意义（P均<0.05）。（6）ERK1/2信号通路关键蛋白表达:与相应对照组相比,年轻小鼠心肌组织和非衰老心肌细胞缺血/缺氧处理后p-ERK/t-ERK比值显著升高,差异有统计学意义（P均<0.05）;而老龄小鼠心肌组织和衰老心肌细胞缺血/缺氧处理后ERK1/2信号通路变化差异无统计学意义。（2）第二部分:（1）老龄小鼠心肌ERK1/2信号通路关键蛋白表达:MI+CaMEK组小鼠心肌组织MEK表达水平和p-ERK/t-ERK比值较其他组均升高,差异有统计学意义（P均<0.05）。（2）老龄小鼠心功能、心肌损伤标志物和心肌梗死面积测定:与MI+GFP组小鼠相比,MI+CaMEK组小鼠MI后3天的LVEF升高而血清LDH和CK水平下降,MI后28天的心肌梗死面积缩小,差异有统计学意义（P均<0.05）。（3）心肌组织ROS水平:与假手术组小鼠相比,MI+GFP组小鼠心肌组织ROS水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与MI+GFP组小鼠相比,MI+CaMEK组小鼠心肌组织ROS水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）心肌组织线粒体融合与分裂调控蛋白表达和ATP水平检测:与假手术组小鼠相比,MI+GFP组小鼠心肌组织Mfn1表达降低、Drp1表达及其Ser616位点磷酸化水平升高,而ATP水平降低,差异有统计学意义（P均<0.05）;与MI+GFP组小鼠相比,MI+CaMEK组小鼠心肌组织Mfn1表达增加、Drp1表达及其Ser616位点磷酸化水平降低,而ATP水平增加,差异有统计学意义（P均<0.05）。（5）凋亡相关调控蛋白表达和细胞凋亡检测:与假手术组小鼠相比,MI+GFP组小鼠心肌组织Bcl-2/Bax比值降低而心肌细胞凋亡比例增加,差异有统计学意义（P均<0.05）;与MI+GFP组小鼠相比,MI+CaMEK组小鼠心肌组织Bcl-2/Bax比值升高而心肌细胞凋亡比例减少,差异有统计学意义（P均<0.05）。（3）第三部分:（1）衰老心肌细胞ERK1/2信号通路关键蛋白表达:缺氧+CaMEK组心肌细胞MEK表达和p-ERK/t-ERK比值较缺氧+GFP组心肌细胞升高,而缺氧+PD98059组心肌细胞p-ERK/t-ERK比值较缺氧+DMSO组心肌细胞降低,差异有统计学意义（P均<0.05）。（2）衰老心肌细胞活力和细胞毒性检测:与缺氧+GFP组心肌细胞相比,缺氧+CaMEK组心肌细胞活力增加而LDH水平降低,差异有统计学意义（P均<0.05）;与缺氧+DMSO组心肌细胞相比,缺氧+PD98059组心肌细胞活力降低而LDH水平升高,差异有统计学意义（P均<0.05）。（3）线粒体ROS水平:缺氧组心肌细胞线粒体ROS水平较对照组升高,缺氧+CaMEK组心肌细胞线粒体ROS水平较缺氧+GFP组心肌细胞降低,缺氧+PD98059组心肌细胞线粒体ROS水平较缺氧+DMSO组心肌细胞升高,差异有统计学意义（P均<0.05）。（4）线粒体融合与分裂调控蛋白、线粒体形态学和功能改变:与对照组心肌细胞相比,缺氧组心肌细胞Mfn1水平降低、Drp1表达及其Ser616位点磷酸化水平升高,线粒体平均长度和平均数量增加,线粒体膜电位和ATP水平降低,差异有统计学意义（P均<0.05）;与缺氧+GFP组心肌细胞相比,缺氧+CaMEK组心肌细胞Mfn1水平增加、Drp1表达及其Ser616位点磷酸化水平降低,线粒体平均长度和平均数量均减少,线粒体膜电位和ATP水平升高,差异有统计学意义（P均<0.05）;与缺氧+DMSO组心肌细胞相比,缺氧+PD98059组心肌细胞Mfn1水平降低、Drp1表达及其Ser616位点磷酸化水平升高,线粒体平均长度和平均数量均增加,线粒体膜电位和ATP水平降低,差异有统计学意义（P均<0.05）。（5）凋亡相关调控蛋白和细胞凋亡检测:与对照组相比,缺氧组心肌细胞Bcl-2/Bax比值降低而细胞凋亡比例增加,差异有统计学意义（P均<0.05）;与缺氧+GFP组心肌细胞相比,缺氧+CaMEK组心肌细胞Bcl-2/Bax比值升高而细胞凋亡比例降低,差异有统计学意义（P均<0.05）;与缺氧+DMSO组心肌细胞相比,缺氧+PD98059组心肌细胞Bcl-2/Bax比值降低而细胞凋亡比例增加,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论:（1）衰老心肌对缺血/缺氧损伤的耐受性明显降低,其ERK1/2信号通路活化明显受限,表明ERK1/2信号通路在衰老心肌损伤中发挥关键的调控作用。（2）本研究构建的AAV9-CMV-CaMEK能够在动物和细胞水平靶向激活心肌ERK1/2信号通路,是干预该信号通路有效的工具。（3）在老龄小鼠中,AAV9-CMV-CaMEK靶向激活心脏组织ERK1/2信号通路能够减轻缺血所致氧化应激损伤,调控心肌线粒体融合和分裂相关蛋白（Mfn1和Drp1）的表达,促进细胞能量供应,抑制细胞凋亡,减轻缺血后的心脏功能损害。（4）在衰老心肌细胞中,AAV9-CMV-CaMEK靶向激活ERK1/2信号通路能够抑制缺氧引起的线粒体ROS过度生成,通过调节线粒体融合和分裂相关蛋白Mfn1和Drp1的表达与活化,促进线粒体融合、抑制线粒体过度分裂,维持线粒体形态和功能稳定,发挥促进细胞生存和抑制细胞凋亡的保护作用。