【摘 要】
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传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)是一种虹彩病毒,近年在广东地区流行,导致养殖鳜鱼大批死亡.通过对病毒基因的测序结果的分析,基因
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传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)是一种虹彩病毒,近年在广东地区流行,导致养殖鳜鱼大批死亡.通过对病毒基因的测序结果的分析,基因组中的五个开放读码框(ORF)被推定编码环指蛋白(RING finger protein):ORF12,ORF65,ORF66,ORF99,ORF111.在该实验中,五个ORF基因被克隆到质粒pMAL-c2中,在体外表达融合蛋白MBP-RING.经过体外泛素化检测实验证明,ORF12,ORF65,ORF66,ORF111编码具有泛素连接酶(ubiquitin ligase enzyme,E3)的功能的环指蛋白,该蛋白在泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素聚合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)、锌离子及ATP的协同下能发挥其功能.通过对ISKNV66蛋白的环指区域关键位点进行突变,发现ISKNV66蛋白的环指区域对于E3酶的功能是至关重要的.为了观察这些环指蛋白在细胞中的分布情况,这五个ORF基因与GFP基因被融合在一起,并构建到pcDNA中,再把这些重组质粒转染FHM细胞.从荧光倒置显微镜中可以清楚地观察到这些环指蛋白分布在细胞的不同位置,12-GFP分布在细胞质中,66-GFP分布在非细胞核的细胞器上,111-GFP在转染早期分布在细胞质中,而后期逐渐集中成一个或几个点.这些蛋白在细胞中的表达对细胞的结构并没有影响.这些结果表明这些蛋白具有不同的功能,而它们作用的真正底物有待继续研究.
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