第一部分：携带Iivin α基因的腺病毒感染DC制作肿瘤疫苗[实验背景]凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成员能够通过BIR结构域(baculovirus IAP repeats domain, BIR)与促凋亡的半胱天冬酶(Caspase)结合,从而细胞抑制凋亡。Livin基因是近年来发现的一种新的IAP家族成员,它有两种剪接异构体分别为Livin α和Livin β。 Livin在正常成人组织中含量甚微或不表达,而普遍过表达于原发性肺癌和其他恶性肿瘤组。肿瘤患者血清中存在Livin蛋白抗体,显示人的免疫系统对Livin蛋白无免疫耐受。腺病毒载体具有高感染效率、高滴度、高表达、可感染分裂和不分裂的靶细胞等许多优点。当重组腺病毒感染宿主细胞后,外源基因可持续表达2周以上,而不会整合到宿主细胞基因组中,保证宿主细胞相对安全。脐带血作为来源丰富的造血干细胞,不易出现复制衰老和免疫衰老。甚至在人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)不匹配时,脐带血移植也较少出现慢性或急性移植物抗宿主反应。利用携带Livin α基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(recombinant adenovirus, rAd)感染脐带血来源树突状细胞(dendritic cell, DC)制成疫苗,使得DC长程有效提呈肿瘤抗原成为可能。[实验目的]1.构建携带人livin α基因的复制缺陷重组腺病毒(rAd-livin α);2.诱导培养健康人脐带血来源的DC细胞；3. rAd-livin α感染DC细胞制作成DC疫苗。[实验方法]1.使用穿梭质粒pDC316-EGFP-livin α和骨架质粒pBHGIox_E1,3Cre共转染293细胞,同源重组产生携带livin α基因的复制缺陷腺病毒rAd-livin α。 rAd-livin α扩增纯化后,对其鉴定并使用TCID50方法检测滴度。2.取健康胎儿脐带血获得单个核细胞,CD34磁珠分选获取前体DC。将细胞培养在含20%胎牛血清的1640培养基中,并添加GM-CSF、SCF以及IL-4诱导DC成熟。3.第5天根据细胞计数,在MOI值200下加入rAd-livin α感染DC,第7天在细胞培养液中添加TNF-α促进DC细胞成熟。即得rAd-livin α DC疫苗。[实验结果]1. rAd-livin α经PCR扩增出符合预期大小的片段,证明rAd-livin α构建成功。病毒滴度为2×109TCID50/毫升。2.培养的成熟DC细胞呈现典型的颗粒增多,体积增大,突起变长的不规则形态。成熟DC细胞表面共刺激分子表达增多。3.rAd或rAd-livin α感染DC细胞后,细胞可呈现绿色荧光。rAd-livin α DC即为肿瘤疫苗。[结论]通过同源重组产生携带livin α基因的复制缺陷腺病毒rAd-livin α。使用磁珠分选从婴儿脐带血单个核细胞中获取前体DC。在多种细胞因子作用下成功诱导前体DC分化、成熟。rAd-livin α感染DC细胞后即获得rAd-livin α DC肿瘤疫苗。做好了为下一步应用研究的前期准备。第二部分：rAd-livin α DC疫苗对肺癌细胞系的杀伤效率及作用机制[实验背景]细胞免疫是机体杀伤肿瘤的最主要环节,有理由认为Livin蛋白可作为抗原通过APC的MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子提呈,从而活化特异性抗Livin的CD4+和CD8+T细胞。我们前期研究发现通过构建携带人livin α基因修饰的小鼠DC疫苗能诱导出抗肿瘤特异性CTL,并产生有明显作用的抗小鼠Lewis肺癌的效应。除了CTL外,在人的免疫系统中还存在一些非特异性的免疫细胞,如自然杀伤细胞(NK cells)、巨噬细胞等也能发挥抗瘤作用。因此本研究中,我们将对livin α基因修饰的脐带血来源的DC疫苗激活脐带血来源的效应细胞(主要成分为CTL)对肺癌细胞系的杀伤效率进行探讨。除研究抗livin特异性T淋巴细胞的抗肿瘤作用外,本实验还观察在DC疫苗发挥作用过程中淋巴细胞向各个亚群分化的情况,以及特异性抗livin T淋巴细胞数量变化,从而进一深入探索rAd-α DC疫苗对肺癌细胞系的杀可能的伤作用机制。[实验目的]1.证实rAd-livin α DC疫苗表达livin α蛋白；2.评估rAd-livin α DC疫苗激活的效应细胞对Livin相关肿瘤细胞的杀伤效率,研究这种杀伤效率是否具有特异性；3.研究rAd-livin α DC疫苗对T淋巴细胞亚群分化的影响,以及抗livin特异性T淋巴细胞的测定。[实验方法]1. Western blot方法检测A549、H460、HBE、rAd-c DC、rAd-livin a DC和单个核细胞Livin蛋白表达；2.以CFSE标记肿瘤细胞,与激活的效应细胞按比例混合,相互作用后使用Annexin V/PI染料通过流式细胞学检测靶细胞凋亡；3.通过RT-PCR方法检测四组T淋巴细胞亚群相应的特异性核转录因子T-bet, GATA3,FOXP3和RORC从而检测T细胞向Th1、Th2、Treg和Th17亚群,分化；流式细胞学检测抗Livin特异性T细胞：Th1(CD4+IFN-γ+T cell、Tc1(CD8+IFN-γ+T cell)、Th2(CD4+IL-4+T cell)和Tc2(CD8+IL-4+T cell)。[实验结果]1. livin蛋白表达于A549、H460肿瘤细胞系和rAd-livin a感染后的DC细胞,不表达于HBE细胞系和脐带血单个核细胞。2.rAd感染DC细胞后,可促进DC细胞成熟和分化,增强DC细胞功能。rAd感染的DC细胞诱导T细胞向Thl细胞分化,rAd-livin a感染的DC细胞除诱导Thl细胞增多外,特异性Tcl淋巴细胞较对照组显著增多。3. rAd-hlivin a DC能增强肿瘤特异性CTL细胞毒作用,而较少出现自身免疫反应。[结论l利用携带livina基因的复制缺陷型重组腺病毒载体感染人脐带血DC细胞,能使DC细胞表达Livin蛋白,提呈Livin抗原,有效致敏同源T淋巴细胞,产生HLA限制性抗Livin相关肿瘤效应,而不引起正常组织的自身免疫效应。