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1 背景骨髓增生异常综合征是一组恶性克隆性血液病。该病发病过程缓慢,以贫血、出血及感染为主要临床特征。同时,在发病过程中,具有向急性髓系白血病转化的风险。通过长期临床观察发现,骨髓增生异常综合征临床证候虚实并见,错综复杂。多数患者起病隐匿,病情缠绵,病程较长,临床多见疲乏无力、心悸气短、面色萎黄,或见午后颧红、五心烦热、咽干舌燥,皮肤瘀斑、瘀点,舌淡红,少苔,脉细等“气阴两虚、血瘀内阻”的症状。因此“气阴两虚,血瘀内阻”是贯穿于骨髓增生异常综合征发病全程的主要病机,故临床可采用“益气养阴活血”的治疗原则。骨髓增生异常综合征的现代发病机制较为复杂,是多种因素综合作用的结局。其中,DNA异常甲基化及Wnt/β-catenin信号通路异常活化与骨髓增生异常综合征的发生、发展及预后密切相关。既往的研究表明,骨髓增生异常综合征患者Wnt信号通路抑制因子高甲基化是导致Wnt信号通路异常激活的重要原因。尽管,去甲基化药物治疗骨髓增生异常综合征疗效已得到认可,临床总反应率较常规治疗已明显提高,但在总生存时间上并无明显优势,而且还会出现明显的不良反应。课题组前期临床实践发现,骨髓增生异常综合征患者经益气养阴活血法组成的“益髓颗粒剂”治疗后,可明显改善患者临床症状,稳定和/或升高外周血象,并能改善和/或舒缓去甲基化药物导致的不良反应。此外,基础研究表明,益髓颗粒剂具有调节机体免疫、血清TGF-β及C-myc表达等综合作用。因此,课题组基于前期临床与基础研究结果,提出益髓颗粒剂治疗骨髓增生异常综合征效应机制是否与去甲基化相关的科学假说。为验证这一假说,我们以Wnt信号通路为主线,以SKM-1细胞皮下荷瘤裸鼠为研究对象,试图阐明益髓颗粒剂治疗骨髓增生异常综合征的潜在的效应机制,并为临床推广应用提供基础研究依据。2 目的通过腹腔注射环磷酰胺,裸鼠皮下种植SKM-1细胞,建立骨髓增生异常综合征荷瘤裸鼠模型。以益髓颗粒剂为干预药物,设立不同实验组,观察药物干预后Wnt信号通路中相关基因及蛋白变化,探讨益髓颗粒剂治疗骨髓增生异常综合征的潜在效应机制。3方法通过腹腔注射环磷酰胺,裸鼠皮下种植SKM-1细胞,建立骨髓增生异常综合征荷瘤裸鼠模型,并设立模型组、阳性药物组、益髓颗粒剂高剂量组、益髓颗粒剂中剂量组、益髓颗粒剂低剂量组。应用流式细胞仪检测移植瘤细胞免疫表型;分组后除模型组不予药物治疗外,阳性药物组按0.5mg/kg/天的剂量给予裸鼠腹腔注射地西他滨,连续给药5天;益髓颗粒剂高、中、低剂量组均按0.2ml/10g/天体积药物灌胃干预14天。第15天实验结束后,脱颈处死裸鼠,剥离各组移植瘤,称重,计算抑瘤率和生存期;采用BSAS、Real-time PCR、Western blot、免疫荧光方法检测Wnt信号通路相关基因或蛋白表达量。4 结果4.1移植瘤的生物学特性检测流式细胞术免疫学分析结果:CD33+的细胞约占单个核细胞的90.3%,CD13+的细胞约占单个核细胞的53.1%,CD11b+的细胞约占单个核细胞的53.6%,CD4+的细胞约占单个核细胞的74.5%,HLA-DR的细胞约占单个核细胞的56.0%,该结果与人MDS细胞株SKM-1主要特性相符。4.2干预效果观察观测结果如下:①体重:益髓颗粒剂各实验组与模型组比较,无统计学意义(P>0.05);阳性药组与各组比较,均有统计学意义(P<0.05)。②肿瘤体积:益髓颗粒剂各实验组与模型组比较,无统计学意义(P>0.05);阳性药组与模型组比较,有统计学意义(P<0.05)。③肿瘤抑制率:阳性药、益髓颗粒剂高、中、低剂量组抑瘤率分别为56.64%、50.691%、26.97%、23.78%。高剂量组、阳性药组瘤重与模型组比较,有统计学意义(P<0.05)。④小鼠生存时间:益髓颗粒剂高剂量组平均生存时间为36.71d,生命延长率为45.2%,与模型组、阳性药组比较,有统计学差异(P<0.05)。4.3效应机制研究研究结果如下:①BSAS检测结果显示,阳性药组、益髓颗粒剂高剂量、中剂量组的SFRP5基因平均甲基化表达水平均低于模型组(P<0.01);阳性药组、益髓颗粒剂高剂量、中剂量组SFRP5基因平均甲基化表达水平均低于益髓颗粒剂低剂量组(P<0.05)。②Real-time RCR检测结果显示,阳性药组及益髓颗粒剂高、中、低剂量组DNMT1 mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05);阳性药组及益髓颗粒剂高、低剂量组SFRP5 mRNA表达水平均高于模型组(P<0.05);阳性药组、益髓颗粒剂高剂量组β-cateninmRNA表达水平均低于模型组(P<0.05);阳性药组、益髓颗粒剂高剂量组C-myc mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05);阳性药组及益髓颗粒剂高、中、低剂量组CyclinD1 mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05)。③Western blot检测结果显示,阳性药组及益髓颗粒剂高、中剂量组DNMT1蛋白表达水平均低于模型组(P<0.05);阳性药组及益髓颗粒剂高、中剂量组SFRP5蛋白表达水平均高于模型组(P<0.05);阳性药组及益髓颗粒剂高、中、低剂量组Wnt3a蛋白表达水平均低于模型组(P<0.05),益髓颗粒剂高剂量组抑制Wnt3a蛋白表达能力高于益髓颗粒剂低剂量组(P<0.05);阳性药组及益髓颗粒剂高、中剂量组β-catenin蛋白表达水平均低于模型组(P<0.05),益髓颗粒剂高、中、低剂量组两两比较,有统计学意义(P<0.05);阳性药组、益髓颗粒剂高剂量组C-myc、CyclinD1蛋白表达水平均低于模型组(P<0.05),阳性药抑制C-myc、CyclinD1蛋白表达能力高于益髓颗粒剂中剂量组(P<0.05)。④免疫荧光法检测结果显示,阳性药组、益髓颗粒剂高、中、低剂量组Wnt3a蛋白表达水平均低于模型组;阳性药组及益髓颗粒剂高、中、低剂量组β-catenin蛋白表达水平均低于模型组。5结论该项研究主要结论如下:①通过腹腔注射环磷酰胺,裸鼠皮下种植SKM-1细胞,建立骨髓增生异常综合征荷瘤裸鼠模型,具有成瘤率高、动物存活时间长的特点,是探讨药物治疗骨髓增生异常综合征机制研究理想模型工具。②益髓颗粒剂能抑制SKM-1细胞皮下移植瘤增殖,延长荷瘤裸鼠生存期。③调控DNA甲基化和Wnt/β-catenin信号通路可能是益髓颗粒剂治疗骨髓增生异常综合征重要疗效机制。