前列腺组织中雄激素受体亚型产生机制、结构特点及其作用的研究一、研究背景前列腺是人体内唯一保持终生生长，而且终生依赖雄激素的器官。雄激素在前列腺的生长发育和前列腺增生（BPH，benign prostate hyperplasia）、前列腺癌（PCa，prostatic cancer）的发病过程中均起着重要作用。雄激素只有和特异性的雄激素受体AR（androgen receptor）结合才能发挥作用。长期以来，人们一直认为AR是单一基因编码的单一蛋白，但大量的生理和病理现象很难用单一的AR来解释。已经在很多动物体内发现了不同结构和功能的AR亚型。在Atlantic croaker和kelp bass中人们也已证实存在两种AR亚型，且分别倾向于与睾酮（T，testosterone）或双氢睾酮（DHT，dihydrotestosterone）结合，这是人们首次证实在同一个生物体内共存两种分别和T及DHT结合的AR亚型。有关人类AR亚型的研究还比较少，但人们在人体的多种组织和器官中均已证实了不同结构和功能的亚型。Wilson等人在人会阴皮肤的成纤维母细胞中发现存在两种不同的AR蛋白，命名为AR-A、AR-B；在对结肠癌的研究中，人们也已证实在结肠癌中存在两种不同的AR亚型表达，而且亚型表达的变化可能是结肠的发病因素之一。尤其是人们近年来发现一种全新的AR，它有别于做为核转录因子的AR，位于细胞膜上，结构和功能与普通AR完全不同，现已证明在体内大多数组织中均有其表达。这些研究有力的证实了AR亚型在人体内不但存在，而且介导不同的功能。对于前列腺这个终生依赖雄激素而且几乎终生增长，但对T和DHT又有不同反应性的器官来说，R亚型的研究就更为重要。但是涉及前列腺中AR亚型的研究很少。在前期的工作中，我们对前列腺中雄激素受体亚型进行了研究论证，用放射性元素氚标记的DHT与AR结合进行等点聚焦电泳（IEF电泳），结果发现：在正常的前列腺组织中存在四个不同等电点的AR亚型表达，而且在正常前列腺的带性结构和病理性的前列腺组织中，AR亚型表现出不同的分布特征。但前列腺中雄激素受体亚型的结构特征和产生机制尚不清楚。AR和孕激素受体（PR，progesterone receptor）、糖皮质激素受体（GR，Rlucocorticoid receptor）、盐皮质激素受体（MR，mineralocorticoid receptor）和雌激素受体（ER，estrogen receptor）均属于核受体超家族，在这一家族成员的研究中人们发现，亚型产生的机制主要有两种，一是由不同基因分别编码，如ER-α和ER-β，二是由同一基因编码，但在转录和翻译过程中不同的起始位点或剪切修饰所致，如PR-A和PR-B；还有一些两者都有，如ER-α又存在多种异构体。这些不同结构的亚型，介导不同的生理功能。PR、ER等其它甾体激素受体亚型的研究发现，亚型的表达有组织特异性，在不同组织和细胞中，亚型的表达并不相同。本课题拟进一步验证AR亚型在前列腺中的表达，并根据上述机制应用现代分子生物学的方法对前列腺中AR亚型的产生机制以及结构特点进行研究，就AR亚型在正常前列腺、BPH中表达特点及在前列腺生长发育和BPH发病中的作用进行探讨。二、研究目的1、进一步验证前列腺组织中雄激素受体亚型的表达，并参照甾体激素受体家族亚型可能的产生机制，应用分子生物学的方法对前列腺组织中AR亚型的产生机制进行探索，进一步明确AR亚型的结构特点。2、明确在前列腺中发现的AR亚型是否在其它雄激素依赖的器官普遍表达，探索AR亚型在男性生殖系统的分布规律。3、探索AR及其亚型在前列腺组织中的表达规律，对AR及其亚型在前列腺阶段性生长以及BPH发病中的作用进行探讨。三、研究方法我们分别选择正常前列腺19例（平均26.7岁，取自器官捐献者），前列腺增生组织20例（平均68.9岁，取自经耻骨上前列腺摘除术），LNCaP细胞进行研究。1、我们选择分别针对AR蛋白N端和C末端的特异性抗体，通过Western Blot对前列腺组织中AR亚型的表达进行检测；通过涵盖AR所有8个外显子的引物进行RT-PCR，以对转录过程中可能的外显子拼接变异进行检测；应用Northern Blot检测因不同起始位点的转录或剪切等造成的mRNA分子的变异。2、对于在前列腺中发现的AR亚型，通过Western Blot检测在泌尿生殖系统的分布规律。3、通过半定量RT-PCR检测正常前列腺移行带和外周带、BPH组织中，AR和TGF-β₁ mRNA的表达分布特征，应用Western Blot检测AR亚型在各种前列腺组织中的表达特点，应用免疫组织化学法研究AR在前列腺基质和上皮中的分布规律。四、结果1、在前列腺组织和LNCaP细胞中，我们通过Western Blot，发现三个不同大小的AR蛋白分子，分子量依次为110KD、95KD、87KD。其中110KD的AR可以被两组抗体识别；87KD能被针对C末端的抗体识别，但不能被针对N端的抗体识别，说明它缺少完整的N端结构；95KD的AR缺少完整的C未端，仅能被针对N端的抗体识别。110KD和87KD的亚型在正常前列腺和BPH以及LNCaP细胞中均有表达，但95KD仅见于LNCaP细胞中微弱表达。RT-PCR未发现变异条带出现，说明在AR基因的转录过程中，没有外显子的脱漏或重复。Northern Blot亦未发现新的变异条带，说明前列腺中没有AR mRNA的异常剪切或不同起始位点的转录。那么，免疫印迹杂交发现的三个亚型均来自同一个mRNA分子，110KD的AR是全长翻译的结果，87KD缺少N端的部分序列，95KD则缺少C末端的部分氨基酸序列。2、在男性泌尿生殖系统中，可以检测到110KD和87KD的亚型普遍表达，但没有发现95KD的AR。在胚胎发育过程中依赖DHT的尿生殖窦原基分化来的外生殖器，如阴茎、阴囊、尿道，和依赖T分化的附睾、输精管、精囊中AR亚型的表达规律相似，均是以110KD的AR表达为主。在膀胱肿瘤组织和正常膀胱粘膜组织中均能检测到110KD、87KD的亚型，在肿瘤组织中87KD／110KD的比值大于正常粘膜组织，但两者差异没有统计学意义（非参数秩和检验u=1.68，p=0.09）。3、在本组正常前列腺中，外周带的AR表达高于移行带，但两种AR亚型的相对表达保持平衡，87KD／110KD的比值在两带间没有显著性差异，而且AR在两带间均是以上皮表达为主，基质间的AR表达阳性率没有差异，TGF-β₁则在移行带的表达高于外周带，这与它的表达受雄激素负性调控相吻合。在BPH组织中，AR和TGF-β₁均明显升高，尤其是87KD／110KD的比值升高，提示87KD的表达增加，亚型间的表达平衡出现变化，改变了BPH组织的激素反应性。AR及其亚型的变化，与TGF-β₁一起共同刺激基质和上皮细胞的增殖，从而促进了BPH的发生发展。五、结论1、我们通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹杂交，进一步证实在前列腺组织和LNCaP细胞中，存在不同结构的AR亚型表达，分子量依次为110KD、95KD、87KD。根据针对AR蛋白两端序列的抗体的识别特点，以及RT-PCR和Northern Blot的结果我们可以推断，上述亚型均来自同一个mRNA分子，亚型的产生来自转录后水平，而且AR基因中间六个外显子编码的肽段序列在三者间完全相同，其结构上的差别仅在于两端的氨基酸残基。其中，110KD是全长翻译的结果；而87KD的亚型结构上与成纤维母细胞中发现的AR-A相同，由内在的起始位点翻译而来，缺少完整的N端；而95KD则缺少完整的C末端，可能是翻译过程中的剪切所致。我们前期通过IEF电泳所发现的四个不同等电点的AR，可能是在磷酸化的结果。而近年来发现的位于细胞膜上的AR，已被证实它在前列腺中表达，那么我们前期的的放射性配体结合的IEF电泳极可能也包括了这一个AR家族的新成员。2、在雄激素依赖的男性生殖系统中，可以发现110KD、87KD的AR亚型普遍表达，但是在各器官中的分布规律相似，均是以110KD为主，并没有出现类似ER亚型在女性生殖系统中，由外到内，ER-α逐渐增多而ER-β逐渐减少的分布规律。在胚胎发育过程中，附睾、输精管和精囊的发育可以直接依赖睾酮的作用，而阴茎等则必须依赖DHT的作用，本组结果中亚型表达规律类似，还不能解释这一现象，但本组选择的均是发育成熟的组织，不能完全代表胚胎发育过程过程中AR亚型的表达。3、前列腺组织中AR及其亚型的表达特征的变化，导致组织对雄激素反应性发生改变，这可能是前列腺阶段性生长和BPH发生发展的基础之一：在第一个快速增长期，外周带的AR高表达和TGF-β₁低表达可能是这种以外周带生长为主增长模式的分子基础之一。在BPH中，总的AR明显升高，亚型间的相对表达量出现变化，87KD的亚型表达增加，这必然会导致前列腺组织对雄激素的反应性出现差异，而AR及其亚型的表达变化，与TGF-β₁高表达一起协同刺激基质和上皮的增殖，使原有的凋亡和增殖平衡被打破，从而促进BPH的发生发展。