研究背景恶性黑色素瘤(malignant melanoma)是黑色素细胞高度恶变而产生的恶性肿瘤,组织胚胎学来源于神经嵴细胞,多数发生于皮肤部位,在所有皮肤恶性肿瘤中恶性黑色素瘤的发病率占第三位。恶性黑色素瘤相对于其他的恶性肿瘤,发病率较低,约占所有恶性肿瘤的1%～3%,但是近年来黑色素瘤的发病率有逐年上升趋势。黑色素瘤具有很高的转移率,在早期就会发生血液及淋巴的转移,患者的死亡率居高不下。权威资料报道:发生恶性黑色素瘤转移的病人的五年生存率不足10%。恶性黑色素瘤发病的危险因素包括以下方面:基因的敏感度、过度的紫外线和环境刺激、痣病史等等,但具体的病因目前仍不明确。目前黑色素瘤的主要治疗手段是手术局部扩大切除,同时进行区域淋巴结清扫,术后辅助应用放疗及常规化疗药物。目前,抗肿瘤辅助治疗(如靶向药物和生物免疫等)的研发与应用也取得一定的进步,但是大部分药物副作用较多,疗效也十分有限。因此,我们需要重新认识这种疾病,探究黑色素瘤的发病机制,明确其诊断、分期和分型,寻求一种更加有效的治疗方式,从根本上改善恶性黑色素瘤的治疗效果。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种来源于基质的多能干细胞。MSCs具有多种组织来源,可见于骨髓、滑膜、脂肪组织、牙周膜和皮肤,具有易于分离和扩增、免疫原性低等特点,而且MSCs具有多向分化潜能和免疫调节能力,在再生医学和组织工程领域有广阔的应用前景,可以促进心血管、神经系统、泌尿系统的修复再生,用于青光眼、糖尿病、心梗等疾病的治疗。另外,MSCs与肿瘤的相互作用也引起研究者的广泛关注。大量文献证实MSCs具有向肿瘤组织归巢的能力,并能够抑制肿瘤组织进展。在前期研究中,我们课题组发现一个新的MSCs的贮存库--胎儿真皮,并成功从中分离出人胎儿真皮间充质干细胞(human fetal dermal mesenchymal stem cells,FDMSCs)。本课题组前期研究发现FDMSCs的旁分泌因子可以抑制瘢痕疙瘩的生长,从而为瘢痕疙瘩的治疗提供了新的治疗策略。目前FDMSCs是否可应用于恶性黑色素瘤治疗方面还未见文献报道。研究目的在体外实验中,我们研究测定FDMSCs条件培养基(conditioned media from FDMSCs,CM-FDMSC)对A375黑色素瘤细胞生物学活性的影响及其可能的机制;在体内实验中,我们研究CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞动物模型的作用。通过两个方面,我们探索FDMSCs相关疗法治疗恶性黑色素瘤的可行性,为将来应用干细胞疗法治疗临床黑色素瘤病人提供实验基础和理论依据。具体如下:1、在体外细胞实验中,测量CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞的活性和增殖的影响。2、评估CM-FDMSC是否诱导A375黑色素瘤细胞凋亡,有无剂量、时间依赖性的特点。3、应用Annexin V-FITC/PI双染色实验,测定CM-FDMSC是否诱导A375黑色素瘤细胞的凋亡。4、应用TUNEL方法,测定CM-FDMSC是否诱导A375黑色素瘤细胞的凋亡。5、通过划痕实验,验证CM-FDMSC是否抑制A375黑色素瘤细胞的迁移能力。6、通过Transwell侵袭试验,测定CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞的侵袭能力的影响。7、CM-FDMSC干预A375黑色素瘤细胞后,A375黑色素瘤细胞PI3K/AKT途径、MAPK途径和线粒体介导的内部凋亡途径的改变。8、建立A375黑色素瘤细胞动物模型,评估CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞动物模型成瘤的影响。研究方法1、提取并鉴定FDMSCs,进一步应用FDMSCs制备FDMSCs条件培养基(CM-FDMSC),应用离心过滤装置制成不同浓度的条件培养基,设立空白对照组,浓度梯度组分别是0.5×CM条件培养基(低浓度处理组)、1×CM条件培养基(中浓度处理组)、2×CM条件培养基(高浓度处理组)。A375黑色素瘤细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得,并进行短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析验证。2、采用CCK-8实验,探讨不同浓度的CM-FDMSC的对A375黑色素瘤细胞影响。种植于96孔板的黑色素瘤细胞,应用不同浓度的条件培养基处理,两天后加入CCK-8溶液,孵育3h后测定吸光度的变化。3、采用EdU结合实验验证不同浓度的条件培养基对A375黑色素瘤细胞增殖的影响。不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞分别种植于6孔板中,加入EdU检测液2h,然后所有细胞核应用Hoechst 33342染色,计算EdU染色阳性细胞核占Hoechst 33342染色细胞核的比例。4、流式细胞术分析不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞凋亡的影响。不同浓度的CM-FDMSC处理A375黑色素瘤细胞两天后,分别加入AnnexinV-FITC和PI,检测凋亡细胞的数量,同时设计了 0,12,24,48和72h时间点,检测凋亡是否有时间依赖性。5、采用TUNEL法,检测不同浓度的CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞凋亡率的影响。不同浓度的CM-FDMSC处理A375黑色素瘤细胞2天后,分别使用TUNEL检测液孵育1h,然后再用DAPI染色,共聚焦显微镜拍照后计算凋亡细胞的比例。6、应用划痕实验,检测不同浓度的CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞迁移能力的影响。A375黑色素瘤细胞置于6cm培养皿中,待形成单层细胞后,划伤单层细胞,形成划痕,两天后观察不同浓度的CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞迁移能力的影响。7、Transwell侵袭试验,检测不同浓度的CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞侵袭能力的调控。不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞加入上室,下室加入含有血清的完全培养基,14h后观察A375黑色素瘤细胞侵袭到下室的细胞数量。8、运用Western blotting技术,检测不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞各自的PI3K/AKT途径、MAPK途径和线粒体介导的内部凋亡途径中的关键信号传导通路蛋白及其磷酸化蛋白的表达量。使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,评估了 PI3K/AKT信号传导通路中相关基因的变化。9、不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞分别注射入4-6周龄裸鼠右腋下皮肤的皮下,5天后,每3天测量肿瘤体积和重量的变化,17天后将裸鼠处死,摘除不同组的荷瘤裸鼠的肿瘤组织,称重并做组织病理学检查。研究结果1、我们可以成功提取FDMSCs。提取细胞在倒置显微镜下符合间充质干细胞形态学特点,流式细胞术检测,提取细胞表达表面抗原CD44、CD90及CD105,符合国际认定间充质干细胞的标准,不表达造血干细胞的常见表面抗原标志(排除),并且具有成骨、成软骨及成脂的分化能力。比对DSMZ数据库细胞,我们的细胞符合A-375的特征,对应的细胞号CRL-1619,从而完成了对A375黑色素瘤细胞的鉴定。2、CM-FDMSC可以抑制A375黑色素瘤细胞增殖,另外我们发现随着CM-FDMSC浓度的增加,A375黑色素瘤细胞的细胞增殖率变小,呈现剂量依赖性的特点。3、通过A375黑色素瘤细胞的EdU结合实验,我们在显微镜下观察A375黑色素瘤细胞的微观变化,可见不同浓度处理组的EdU染色阳性细胞核的比例大致相同,无明显的统计学意义。4、通过流式细胞术分析AnnexinV-FITC/PI双染色分布特点,我们观察到不同浓度CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞可以产生凋亡,呈现剂量依赖的方式。在不同时间点的检测中,我们发现CM-FDMSC诱导A375黑色素瘤细胞凋亡具有时间依赖的特点(随着CM-FDMSC作用时间的延长,A375黑色素瘤细胞凋亡率增加)。5、应用共聚焦显微镜,我们在显微镜下观察TUINEL染色细胞占DAPI染色的比例随着CM-FDMSC浓度的增加而增加,不同浓度处理组之间有统计学意义。具有剂量依赖性的特点。6、通过划痕实验,我们发现不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞迁移能力均受到抑制。不同浓度处理组的愈合比的差异具有统计学意义。7、通过Transwell侵袭试验,我们同样发现不同浓度的CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞侵袭能力有抑制作用。不同浓度的CM-FDMSC处理的A375黑色素瘤细胞加入上室,下室加入含有血清的完全培养基,14h后我们观察A375黑色素瘤细胞侵袭细胞的数量。与对照组相比,我们发现Transwell上室膜的下表面的细胞数量随着CM-FDMSC的浓度的升高而越来越少,实验结果表明不同浓度处理组之间有统计学意义。8、采用Western blotting技术,我们检测了三通路的蛋白表达水平的变化,CM-FDMSC处理A375黑色素瘤细胞后,PI3K、AKT和ERK蛋白的磷酸化降低,BAX蛋白表达上调,BCL-2蛋白表达下调。总的PI3K、AKT和ERK蛋白变化不大,其中BCL-2/BAX比值变小,整体趋势向着促凋亡的方向发展。不同浓度处理组之间表现出统计学的差异。同时,我们应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测了 PI3K/AKT信号传导通路中PI3K和AKT基因水平的变化。两种方法显示:A375黑色素瘤细胞的PI3K/AKT和MAPK信号传导通路都受到抑制。9、通过检查荷瘤裸鼠的肿瘤体积和重量,我们发现,随着CM-FDMSC浓度的增加,不同浓度处理组肿瘤体积和重量变现为下降的趋势。通过组织学检查,我们发现随着CM-FDMSC浓度的增加,A375黑色素瘤细胞的数量和密度逐渐减少。CM-FDMSC浓度加大后,荷瘤裸鼠的肿瘤组织的结缔组织变得丰富,肿瘤包膜厚度逐渐增加。研究结论采用CCK-8测定、EdU结合试验、AnnexinV-FITC/PI双染色测定、TUNEL实验、划痕实验、Transwell侵袭实验、Western blotting实验以及动物肿瘤形成实验等方法检测CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞的抗肿瘤作用。1、CM-FDMSC在体外实验以剂量依赖性的方式抑制A375黑色素瘤细胞的肿瘤活性,表现为细胞活性、迁移能力和侵袭能力降低。2、CM-FDMSC处理A375黑色素瘤细胞后,A375黑色素瘤细胞的凋亡有剂量和时间依赖性的特点。3、CM-FDMSC处理A375黑色素瘤细胞后,CM-FDMSC可以促进A375黑色素瘤细胞晚期凋亡。进一步研究发现,可能通过调控PI3K/AIKT、MAPK及线粒体介导的凋亡信号传导通路发挥抗肿瘤作用。4、CM-FDMSC在动物实验中对A375黑色素瘤细胞裸鼠荷瘤的形成也有抑制作用。CM-FDMSC可抑制A375黑色素瘤细胞的成瘤行为。CM-FDMSC改变A375黑色素瘤细胞荷瘤裸鼠的瘤体的结构和成分。研究意义FDMSCs是一种新颖的间充质干细胞,国内外未见用于A375黑色素瘤治疗的文献报道。本实验首次证实了 CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞有较强的抑制细胞增殖活性及诱导凋亡作用,且CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞的迁移和侵袭都有抑制作用。为挖掘CM-FDMSC抗肿瘤作用的深层原因,我们从三个信号传导通路观察CM-FDMSC对A375黑色素瘤细胞的通路蛋白及基因的影响,三个信号传导通路分别是PI3K/AKT、MAPK以及线粒体介导的凋亡信号传导通路,这些通路的发现可以帮助我们理解A375黑色素瘤细胞发病的机制,有望进一步提高A375黑色素瘤细胞的治疗效果。重要的是,我们发现CM-FDMSC对A375荷瘤裸鼠肿瘤的形成同样起到抑制作用,有希望将来进行相关的预临床试验,从而把我们的发现推向临床,提高黑色素瘤病人的疗效,改善病人的生活质量。