【摘 要】
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目的探讨舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对乳腺癌细胞增殖与转移能力的影响及其作用机制。方法第一部分:(1)通过细胞培养记录并绘制BT474乳腺癌细胞的生长曲线。(2)CCK-8实验检测不同浓度帕瑞昔布钠(0μM,62.5μM,125μM,250μM,500μM,1000μM,2000μM,4000μM)对BT474乳腺癌细胞增殖能力的影响,并计算帕瑞昔布钠IC50值;同时检测不同时间段(12 h,24 h,
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目的探讨舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对乳腺癌细胞增殖与转移能力的影响及其作用机制。方法第一部分:(1)通过细胞培养记录并绘制BT474乳腺癌细胞的生长曲线。(2)CCK-8实验检测不同浓度帕瑞昔布钠(0μM,62.5μM,125μM,250μM,500μM,1000μM,2000μM,4000μM)对BT474乳腺癌细胞增殖能力的影响,并计算帕瑞昔布钠IC50值;同时检测不同时间段(12 h,24 h,48 h,72 h)帕瑞昔布钠、舒芬太尼及舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞增殖能力的影响,选择最佳实验剂量与处理时间用于后续细胞实验。(3)平板克隆形成实验检测舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞克隆形成能力的影响。(4)流式细胞周期实验检测舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞周期的影响。(5)Western Blot实验检测不同时间段(12 h,24 h,48 h,72 h)帕瑞昔布钠、舒芬太尼及舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌Cyclin D1蛋白表达的影响。第二部分:(1)基质黏附实验检测舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞黏附能力的影响。(2)划痕实验检测舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞迁移能力的影响。(3)transwell侵袭实验检测舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞侵袭能力的影响。(4)Western Blot实验检测舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞MMP-9、COX-2、VEGFA及EMT相关蛋白表达的影响。第三部分:(1)构建FVB/N小鼠乳腺癌原位移植模型,采用不同分组处理并记录小鼠生长情况,分析小鼠体重、肿瘤体积、荷瘤率以及生存曲线的改变,了解舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对乳腺癌小鼠肿瘤生长的影响。(2)通过HE染色、免疫组化染色、Western Blot实验,分析小鼠肺转移、乳腺癌组织血管生成以及乳腺癌组织MMP-9、COX-2、VEGFA、EMT相关蛋白的表达情况,了解舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对乳腺癌小鼠肿瘤转移的影响。结果第一部分:(1)根据细胞生长曲线可知细胞培养3~6天时,BT474乳腺癌细胞处于对数生长期,细胞呈岛叶状生长、贴壁良好。(2)CCK-8实验结果显示,帕瑞昔布钠可抑制BT474乳腺癌细胞的增殖并呈剂量依赖性(P<0.05),IC50值为299.5μmol/L;同时随处理时间的延长,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞的增殖抑制率呈明显上升改变,以处理24h最为显著(P<0.05)。(3)平板克隆形成实验结果显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠可显著减少BT474乳腺癌细胞的克隆形成数(P<0.05)。(4)流式细胞周期实验结果显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠能够使BT474乳腺癌细胞阻滞于G1期,减少进入S期的比例,从而抑制细胞的增殖(P<0.05)。(5)Western Blot实验结果显示,随处理时间的延长,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞周期蛋白Cyclin D1表达呈逐渐下调改变,以处理24h最为显著(P<0.05)。第二部分:(1)基质黏附实验结果显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠可使BT474乳腺癌细胞的黏附率下降(P<0.05)。(2)划痕实验结果显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠可使BT474乳腺癌细胞的伤口愈合率减小(P<0.05)。(3)transwell侵袭实验结果显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠可使BT474乳腺癌细胞的侵袭数减少(P<0.05)。(4)Western Bolt实验结果显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对BT474乳腺癌细胞MMP-9、COX-2、VEGFA蛋白的表达呈下调改变(P<0.05),同时还可上调上皮表型标志物E-cadherin蛋白表达(P<0.05),下调间质表型标志物N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达(P<0.05)。第三部分:(1)通过记录小鼠生长情况,显示舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对小鼠体重增长影响较小且还能增加小鼠荷瘤率,延长其生存时间。(2)HE染色实验与免疫组化染色实验显示,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠不仅减少乳腺癌小鼠肺转移结节数,而且还可降低乳腺癌组织内的血管生成(P<0.05)。Western Blot实验结果得出,舒芬太尼复合帕瑞昔布钠对小鼠乳腺癌组织MMP-9、COX-2、VEGFA蛋白表达呈下调改变(P<0.05),同时还可上调E-cadherin蛋白表达(P<0.05),下调N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达(P<0.05)。结论1.舒芬太尼复合帕瑞昔布钠可抑制BT474乳腺癌细胞增殖与转移。2.舒芬太尼复合帕瑞昔布钠可抑制乳腺癌小鼠肿瘤生长与转移。3.舒芬太尼复合帕瑞昔布钠抑制乳腺癌细胞增殖与转移可能与抑制EMT转变有关。
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