长久以来,多重耐药菌感染所致慢性阻塞性肺疾病的急性发作（AECOPD）是造成临床患者死亡的主要原因,目前由于抗生素的滥用以及糖皮质激素药物敏感性的降低,西药常规治疗AECOPD患者的临床疗效不尽理想,而有关多重耐药菌感染所致慢性阻塞性肺疾病急性发作期的动物模型还不成熟,所以建立可控的AECOPD动物模型以及开发新的中药和中西药联用治疗AECOPD具有重要意义。实验目的本实验采用香烟烟熏联合气管滴注焦油建立大鼠慢性阻塞性肺疾病动物模型,并在慢性阻塞性肺疾病动物模型的基础上进行气管滴注多重耐药铜绿假单胞菌建立多重耐药菌感染所致慢性阻塞性肺疾病急性发作期动物模型,研究AECOPD大鼠模型中肺功能、血氧饱和度、免疫功能、病理变化、炎性因子及相关炎性变化等。并进一步探讨疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致慢性阻塞性肺疾病急性发作期的治疗作用以及相关治疗作用机制。实验方法1.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立首先建立慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型,明确烟熏时间、烟熏条件、香烟数量、焦油滴注时间、焦油滴注量等,在COPD动物模型的建立过程中,对2个大鼠品系（SD、Wistar）三种不同体重规格（50-70g、130-150g、180-200g）大鼠进行研究。通过香烟烟熏联合气管滴注香烟焦油建立慢性阻塞性肺疾病动物模型,选择最优品系以及体重规格建立COPD模型。通过肺功能、血气分析检测鉴定COPD模型是否成功。2.多重耐药铜绿假单胞菌诱导COPD大鼠急性发作模型的建立本试验取10只大鼠作为正常对照组,其余大鼠按照试验一造模方法进行造模,模型建立成功后,将COPD模型组大鼠组44只随机分为,COPD模型组、AECOPD模型组各10只用做肺功能血氧饱和度的测定;其余24只随机分为AECOPD感染24h组、AECOPD感染72h组、AECOPD感染120h组、AECOPD感染168h组,每组六只用于肺组织中细菌菌落数、病理变化检测。除正常对照组和COPD模型对照组外,其余五组大鼠在异氟烷轻度麻醉后,以耐药铜绿假单胞菌菌液浓度为6×108cfu/ml的多重耐药铜绿假单胞菌气管滴注感染,每只200μl。感染后,对COPD模型组、AECOPD模型组以及正常对照组每天进行肺功能检测、血氧饱和度检测,观察大鼠COPD合并多重耐药铜绿假单胞菌的急性发作期。AECOPD感染24h组、AECOPD感染72h组、AECOPD感染120h组、AECOPD感染168h组分别于感染后24h、72h、120h、168h腹主动脉取血后解剖,检测以下指标:右肺进行细菌菌落计数、左肺进行肺组织病理学检查。3.疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致AECOPD Wistar大鼠模型治疗作用的研究造模同实验方法2,取70只体重为130-150g Wistar大鼠,随机分为正常对照组、COPD模型组、AECOPD模型组、耐药左氧氟沙星组、敏感阿米卡星组、疏风解毒胶囊高剂量组、疏风解毒胶囊低剂量组。除正常对照组外,其余大鼠按实验方法2进行造模。感染前及感染后第5天进行肺功能检测、血氧饱和度检测;检测完成后腹主动脉取血,进行血常规检测;肺组织通过HE染色对肺组织病理学检测;采用RT-PCR法,检测肺组织中多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因的表达量;并通过多因子分析、ELISA法进行肺组织中炎性细胞因子、趋化因子以及细菌标志物含量测定,通过以上方法研究疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致AECOPD大鼠模型的治疗作用。4.疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致AECOPD Wistar大鼠模型的治疗作用机制研究取实验3的大鼠进行腹主动脉采血采用流式细胞术进行T淋巴细胞亚群比例分析;取材后进行马松染色标记肺组织中胶原含量,对大鼠肺组织中胶原沉积量进行定量检测;采用AP-PAS染色法对杯状细胞进行染色,对大鼠肺组织黏液的沉积进行定量检测;采用ELISA法进行肺组织中COL-1、COL-3胶原蛋白含量检测;通过免疫荧光法对肺组织中EGFR、MUC5AC蛋白进行定量检测;采用Western Blot法对肺组织中EGFR、P-EGFR、MUC5AC黏液分泌通路相关蛋白进行定量检测、对肺组织中TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3肺部纤维化通路相关蛋白进行定量检测;从而对疏风解毒胶囊治疗AECOPD的作用机制进行评价。实验结果1.慢性阻塞性肺疾病动物模型的建立1.1动物的选择本实验共筛选了 2个大鼠品系（SD、Wistar）、3个体重规格（50-70g、130-150g、180-200g）,从大鼠一般体征、成模时间、模型稳定性等相关指标进行了评价。其中采用130-150g的Wistar大鼠建立AECOPD大鼠模型成模时间最短且稳定,随着烟熏进行过程中大鼠出现萎靡不振、炸毛、毛色变黄、活动量减少、咳嗽、饮水量增加进食量减少等一般体征表现;并且体重增长缓慢与正常对照组比具有明显差异（P＜0.01）;COPD组肺功能呼吸气峰流速、潮气量等均明显降低（P＜0.01）,并且血氧饱和度也降低明显（P＜0.01）,达到COPD模型建立标准。1.2烟熏条件的选择1.2.1香烟的选择:根据COPD临床病因（香烟烟雾以及大气污染等）选择香烟烟熏大鼠进行造模。香烟的选择:采用焦油一氧化碳含量相对较大、价格较为便宜的黄果树（焦油量10mg、烟气烟碱量0.9mg、烟气一氧化碳量12mg）作为本次实验用香烟。1.2.2烟熏时间:实验摸索得每次烟熏一小时、每天烟熏两次大鼠达到各方面综合的最优状态（状态较差且不会发生死亡）1.2.3香烟数量:130-150g Wistar大鼠每次烟熏平均每只老鼠熏0.5只香烟1.3烟熏机条件:1.3.1烟熏机固定参数:根据实验得到烟熏机固定参数为烟雾排出流量1.8L/min,点烟时间和排出余烟时间为10s。1.3.2烟熏机参数的调节:可根据大鼠数量确定香烟数量,再根据每次烟熏一小时确定排烟泵运行时间,再根据泵运行时间确定加氧流量。具体如下:#121.4焦油气管滴注条件确定:相关实验结果表明:根据相关预实验确定焦油浓度为原浓度、每次焦油滴注50μl,频次为七天一次,周期为45天（具体周期以肺功能血氧饱和度下降为准）,大鼠状态良好。2.多重耐药铜绿假单胞菌诱导COPD大鼠急性发作模型的建立一般情况表明:感染后大鼠呼吸急促,蜷缩于笼子角落,24小时内几乎不运动,伴有体温升高,毛发炸毛严重,随着时间推移逐渐恢复。病理结果表明:感染后24h,AECOPD模型对照组大鼠肺部病理检查肺组织具有心衰细胞,肺泡腔充血中性粒细胞浸润,肺泡腔内见巨噬细胞,随着时间推移感染后72h、120h炎症细胞浸润逐渐减轻;肺功能结果表明:在感染后肺功能会进一步受限,但随着时间推移逐渐恢复,与临床AECOPD患者具有高度一致性;呼吸频率曲线和松弛时间曲线等相关参数表明:耐药铜绿假单胞菌感染后,AECOPD组肺功能在24-120h相比较于COPD模型组处于急性下降稳定状态（P＜0.01）,168h处于恢复期,相关参数恢复明显;血氧饱和度结果表明:血氧饱和度在48-120h均处于急性下降稳定状态,与COPD模型组相比具有明显差异（P＜0.01）,168h时恢复;肺组织菌落计数结果表明:大鼠肺组织活菌数在24h时达到最大后逐渐减少,但五天内菌落数下降较为平缓,第七天下降迅速,但炎症持续存在。相关结果表明,大鼠恢复较快。但耐药菌感染后的前五天,Wistar大鼠建立多重耐药铜绿假单胞菌感染致慢性阻塞性肺疾病急性加重期模型较为稳定,相关结果表明在耐药铜绿假单胞菌感染后120h内处于慢性阻塞性肺疾病急性加重期。3.疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致AECOPD Wistar大鼠模型治疗作用的研究肺功能结果表明:给予疏风解毒胶囊后高剂量组可明显升高松弛时间、潮气量、呼气量,与AECOPD模型组大鼠相比具有显著性差异（P＜0.01;P＜0.05）;高剂量组和低剂量组均可明显降低呼吸频率,与AECOPD模型组大鼠相比具有显著性差异（P＜0.01;P＜0.05）;疏风解毒胶囊高剂量组和低剂量组均可明显升高呼气峰流速与吸气峰流速,与AECOPD模型组大鼠相比具有显著性差异（P＜0.01;P＜0.05）,证明疏风解毒胶囊对AECOPD大鼠肺功能具有改善作用。血氧饱和度结果表明:疏风解毒胶囊高剂量组和低剂量组均可明显升高大鼠血氧饱和度,与AECOPD模型组大鼠相比具有显著性差异（P＜0.01）,表明疏风解毒胶囊对AECOPD大鼠血氧饱和度具有改善作用。并且疏风解毒胶囊高低剂量组对纤毛断裂脱落、炎性细胞浸润等病理变化均有不同程度改善,且两个剂量组可明显降低肺组织匀浆菌落数,与AECOPD模型组大鼠相比具有显著性差异（P＜0.01）,耐药基因检测结果表明:疏风解毒胶囊高低剂量组均能明显降低大鼠肺组织中mexA、mexB两个耐药基因的表达,表明疏风解毒胶囊能降低肺组织耐药菌定植。肺组织细菌标志物、炎性因子、趋化因子检测结果表明:疏风解毒胶囊高低剂量组细菌标志物CRP明显降低,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.01）。疏风解毒胶囊高剂量组趋化因子CXCL1明显降低,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.01）;并且疏风解毒胶囊低剂量组大鼠趋化因子12（CXCL12）明显降低,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.05）。疏风解毒胶囊大鼠肺组织中高低剂量组炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6均明显降低,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.01）;并且疏风解毒胶囊高剂量组大鼠肺组织中IL-10明显降低,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.01）。血常规结果表明:疏风解毒胶囊高剂量组大鼠外周血淋巴细胞数明显升高,与AECOPD组具有显著差异（P＜0.01）;疏风解毒胶囊高剂量组大鼠外周血中性粒细胞数明显降低,与AECOPD组具有显著差异（P＜0.05）;疏风解毒胶囊低剂量组大鼠外周血白细胞数明显降低,与AECOPD组具有显著差异（P＜0.05）,表明疏风解毒胶囊可以抑制机体炎症反应。治疗给予疏风解毒胶囊4天后,疏风解毒胶囊两个剂量组均呈现出一定的治疗作用。在其范围内可以减少肺部细菌定植,改善肺组织病变,降低外周血炎性细胞水平、降低肺组织中炎性细胞水平、降低趋化因子水平、降低肺组织中细菌标志物CRP的水平、降低相关炎性因子水平、改善肺功能、提高血氧饱和度等,以上结果表明疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致慢性阻塞性肺疾病的急性发作期Wistar大鼠具有明显的治疗作用。4.疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致AECOPD Wistar大鼠模型的治疗作用机制研究流式细胞术结果表明:疏风解毒胶囊低剂量组大鼠外周血鼠外周血CD4+T淋巴细胞比例明显升高,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.05）;CD8+T淋巴细胞比例明显降低,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.05）;CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值明显升高,与AECOPD模型对照组比具有显著差异（P＜0.05）,表明疏风解毒可提高机体免疫水平。Masson染色和Elisa检测胶原蛋白结果表明:疏风解毒胶囊可减少肺组织中COL-1、COL-3胶原蛋白的表达减少胶原沉积,从而减轻大鼠肺部纤维化。AP-PAS染色结果表明:疏风解毒胶囊可减少杯状细胞增生、化生,减少粘液分泌。免疫荧光分析结果表明:疏风解毒胶囊可明显降低EGFR、MUC5AC蛋白表达的表达量;相关黏液及纤维化蛋白进行了 WB检测结果表明:疏风解毒胶囊可明显减少黏液分泌以及胶原沉积,并对EGFR的磷酸化有明显抑制作用并且对Smads2/3的蛋白表达以及磷酸化均有明显抑制作用,且能抑制MUC5AC、TGF-β1蛋白的表达。荧光和WB结果表明:给予疏风解毒胶囊治疗后EGFR磷酸化明显下降,表明EGFR激活被阻断,并且下游MUC5AC黏性蛋白含量明显减少;TGF-β1蛋白含量明显下降,并且Smad2/3磷酸化水平降低,表明TGF-β1/Smad2/3通路激活被阻断。治疗给予疏风解毒胶囊4天后,疏风解毒胶囊两个剂量组均呈现出一定的治疗作用。在其范围内可以减少增强机体免疫能力,减少胶原沉积、降低黏液分泌,改善肺组织病变,降低外周血炎性细胞水平等方面从而改善肺功能、提高血氧饱和度,从而发挥对AECOPD的治疗作用,且其作用机制可能通过降低机体炎性反应,减少香烟造成的炎性因子的产生,从而减少EGFR的激活、磷酸化,减轻下游杯状细胞的增生化生从而减少黏液分泌;并通过降低TGF-β1因子的表达,来抑制TGF-β1/Smad2/3通路的激活,从而减少胶原沉积,通过提高机体免疫能力、降低机体炎性反应等方面发挥治疗作用的。实验结论本实验摸索了2个动物品系3种体重规格、烟熏条件、焦油气管滴注条件、多重耐药铜绿假单胞菌的感染量等相关参数,通过肺功能、血氧饱和度、肺部病变情况以及感染后肺部菌落数变化,确定了 AECOPD模型建立相关参数条件,并且相关条件下可重现AECOPD模型,证明AECOPD模型建立稳定,并且与临床一致。疏风解毒胶囊对多重耐药铜绿假单胞菌感染所致慢性阻塞性肺疾病的急性发作期Wistar大鼠模型具有明显的治疗作用并且是通过降低黏液分泌以及减少肺部纤维化等机制发挥治疗作用。创新点1优化了 COPD动物模型,采用气管滴注焦油代替了气管滴注LPS,使其还原了临床COPD患者的发病条件,使其更符合临床,并且模型稳定,重现性高。2目前国内外报道相关药物治疗AECOPD只存在与临床用药分析,对体内对AECOPD的药效机制鲜有报道,本次模型建立成功与稳定后,可进行大规模药物筛选,对临床用药具有指导意义。