细菌的cAMP受体蛋白（Cyclic AMP receptor protein，简称CRP），也被称作代谢基因激活蛋白，在基因的转录调控中发挥重要作用。别构效应物cAMP的结合能够诱导CRP发生构象变化从而与DNA特异性结合，进而招募RNA聚合酶（RNAP）至启动子，最终调控200多个基因的转录。作为最早被纯化并得到三维结构的转录激活蛋白，cAMP介导的CRP的变构已经成为研究转录激活变构机制的经典模型。　　目前普遍认为CRP存在三种结构状态:(1)无配体，无活性的“off”态;(2)无配体，有活性（或有配体，无活性）的中间态;(3)有配体，有活性的“on”态。已经提交至PDB的24个CRP相关的晶体结构中，除apo-CRP及D138L突变体结构属于“off”态外，其它均属于“on”态。限于apo-CRP的结构分辨率为3.6(A)，无法描述结构中更多的细节，而对于CRP中间态的结构则一直未有报道。因此，准确地理解CRP的变构过程及机制并为其它转录调控提供参考还有一定困难。此外，在15个含DNA的CRP的复合物结构中，结晶时所选用的DNA均不连续，由两段含4bp的粘性末端的序列互补配对形成一个对称的结合位点与CRP二聚体结合。这种不连续的DNA在功能上是否能替代连续的DNA，这也是一个值得思考的问题。　　本课题以分子生物学与结构生物学为研究手段，通过对CRP相关结构的测定及分析，以更好地理解CRP的结构细节及其变构机制。　　表达纯化了野生型CRP蛋白，并获得了分辨率为2.5(A)的野生型apo-CRP的晶体结构。空间群为P21，每一个异构单元含四个蛋白分子。与之前3.6(A)的apo-CRP(PDB ID:3HIF)的结构相比，主要有两个不同。首先，在β折叠6，7间的loop区观察到短的α螺旋，这与NMR的数据一致。另外，连接两个结构域的铰链区在长度与构象上也表现出差异，这表明CRP的铰链区至少应该包括T127至D138的序列，而非之前3HIF中观察到的V131-D138，更不是传统定义的L134-D138，这与CRP家族中的另一个蛋白PrfA的结构相似。同时，结构中分子构象的异质性提示:即使没有cAMP结合，任何外界的刺激或胞内生理环境的改变都可能引起apo-CRP整体构象的调整。不仅表现在C端结构域相对于N端结构域的位置差异，还可能存在以无规卷曲与α螺旋的相互转化为代表的二级结构的改变。　　成功解析了分辨率为2.9(A)的野生型CRP与全长DNA的复合物的晶体结构。CRP-cAMP-DNA(全长)复合物的晶体结构的空间群为P3121，每一个异构单元含一个蛋白分子，一个cAMP及DNA。DNA密度虽不完整，但包含TGTGA在内的22bp的保守序列清晰可见。这个结构与CRP-cAMP-DNA(半长)(PDB ID:1ZRC)的结构大体相似，表明1ZRC中使用的不连续DNA在结构与功能上可以替代序列上完全相同的连续DNA。这也进一步证明之前使用半长DNA的15个结构中DNA的结合方式与构象基本能代表真实结构，并为以后长序列DNA的结晶提供了一个方法。　　构建了一系列CRP突变体，D53H，S62F，G141S，G141R，G141K，G141D，R142C，L148R。在无cAMP时，这些突变体仍有转录激活活性，被认为是无配体、有活性的中间态，常用CRP*表示。经过表达纯化结晶，获得了D53H，S62F，G141D的晶体，并收集到分辨率为2.9(A)的D53H CRP的晶体衍射数据。经过结构解析，确定其空间群为P212121，每一个异构单元含有八个蛋白分子。作为第一个被报道的CRP的中间态结构，其与apo-CRP及cAMP-CRP的结构都有较大差异。若以DNA结合结构域是否发生翻转为标准，可认为其结构接近野生型apo-CRP，被认为是变构过程的初期构象。这与之前一致认为的CRP*在结构与功能上都类似甚至等同于cAMP-CRP完全不同。　　制备了不含cAMP的D53H CRP-DNA(半长)复合物的晶体并获得了分辨率为3.4(A)的晶体结构。空间群为P212121，每一个异构单元含两个蛋白分子，结构中蛋白主链及DNA均清晰可见。虽然D53H CRP的构象与cAMP-CRP的差异很大，但与DNA结合后，在构象及与DNA的作用方式上都与cAMP-CRP代表的“on”态基本相似。这个结构不但为D53H CRP属中间态构象提供了重要支撑，同时，还表明CRP在与DNA的相互作用中可能存在协同变构的效应。　　根据以上四个结构及PDB中已有的CRP结构数据，建立了新的的变构机制模型并阐述了变构过程的细节。当cAMP结合后，呈“off”态的apo-CRP在动力学上的平衡被打破，cAMP结合引起的局部变化通过信号网络逐级放大，导致整体的变构效应。在变构的初期，CRP的构象最为松散，两个亚基的C端结构域以刚体的形式向同一侧运动，铰链区处于高度无序与伸展状态为其运动提供足够的动力与空间。Eα螺旋与Fα螺旋（CRP结构上的第五个、第六个α螺旋）突出识别特异性DNA，与DNA协同变构。随着变构进程的深入，DNA结合结构域整体翻转与DNA结合，整体构象逐渐趋于另一种平衡，Cα螺旋延长、两个亚基相互作用增强稳定“on”态构象。这个变构模型的总体变构过程与Won等人提出的局部变化引起整体结构的转化较为接近。