pEGFP-c-fos在T24细胞的表达及在贝毒检测中的应用

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目的:构建含c-fos启动子的pEGFP-c-fos重组质粒载体。将重组质粒载体转入膀胱移行细胞瘤T24细胞中,筛选获得稳定表达株。加入贝毒后,利用细胞中绿色荧光蛋白表达水平的变化进行贝毒素的检测,建立一种以细胞为基础的受体水平的贝毒检测方法。 方法:用PCR扩增c-fos启动子片断,进行VspI、EcoRI双酶切,获得含粘性末端的片断。将该片段与同样双酶切的pEGFP-N1质粒进行连接,构建pEGFP-c-fos重组质粒载体。用PCR、双酶切鉴定,最后测序鉴定。利用脂质体法将重组质粒pEGFP-c-fos转入人膀胱移行细胞瘤T24细胞中,通过G418筛选得到稳定表达株。加入梯度神经性贝毒(neurotoxic shellfish poisoning,NSP),或加入梯度麻痹性贝毒(Paralytic shellfish poison,PSP)后在经10ng/ml的NSP处理,利用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白表达的变化,并拍摄不同贝毒水平下绿色荧光蛋白的表达图像。利用美国Image-pro Plus专业图像分析软件对图像进行荧光强度定量分析,绘出绿色荧光表达强度与不同浓度NSP、PSP毒素的关系曲线。 结论:构建pEGFP-c-fos重组质粒载体并使之在T24表达。筛选得到的稳定表达株在经过NSP诱导下,发出较强的荧光,表明重组质粒pEGFP-c-fos在T24细胞中成功表达。建立了绿色荧光表达强度与不同浓度NSP毒素或PSP毒素的关系曲线,为构建以细胞为基础的受体水平的NSP和PSP贝毒检测方法奠定了基础。
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