论文部分内容阅读
肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，居我国癌症死亡的第三位。大约有80％的HCC与乙肝病毒(HeptitisBVirus，HBV)感染有关，其致病机理比较复杂，危害严重。HBV基因组包含4个开放阅读框，包括S、C、P和X区，分别编码相应的抗原蛋白。HBx是HBV基因组所编码蛋白质中唯一具有多种调控功能的病毒蛋白质，可反式激活一些细胞的原癌基因及病毒的基因，HBx通过多种方式直接或间接地对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程产生广泛的影响。HBx的这种现象与机制在近些年成为研究的热点，逐渐阐明HBx与宿主蛋白质广泛地相互作用，但HBx诱发肝细胞癌的具体机制仍不完全清楚。本研究利用二维差异凝胶电泳技术(Two-dimensionalDifferentialIn-gelElectrophoresis，DIGE)，以期通过比较相关肝细胞在转染HBx前后细胞蛋白质表达水平的差异，找到HBx与HCC密切相关的差异蛋白。
为了进行乙型肝炎病毒(HBV)X基因相关肝细胞癌变的差异蛋白质组学分析，我们构建了HBx相关的肝细胞模型。首先参考GenBank核苷酸序列库中的HBV核苷酸序列设计合成了一对用于HBx基因扩增的引物，以质粒V5为模板，扩增两端分别包含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列。然后将EGFP载体及X基因的PCR产物双酶切后用T4连接酶将两者连接并转化大肠杆菌JMl09，所构建的重组质粒命名为EGFP-HBx。将重组质粒用脂质体转染肝细胞Changliver及HepG2，激光共聚焦显微镜下检测其转染效率，并挑选已转染的细胞进行单克隆培养，在G418的作用下筛选稳定株细胞，使用RT-PCR和WesternBlotting检测HBx的表达情况，进一步用流式细胞术分析HBx转染进细胞Changliver后细胞周期发生的变化。双酶切结果和序列分析表明重组质粒构建成功。激光共聚焦显微镜下观察到HBx转染到HepG2的效率要比Changliver高，RT-PCR和WesternBlotting结果都能证实HBx在细胞Changliver及HepG2已表达，而且流式细胞术分析表明HBx蛋白加快了细胞周期进程，进一步证实HBx能促进细胞的增殖。
利用二维差异凝胶电泳技术DIGE技术研究肝癌细胞与正常细胞的差异时应先对其蛋白样品进行标记系统评估，以确保正式实验的成功。我们对提取样品进行了2DE的重复性实验，结果显示其重复性都能达到90％以上。然后将提取的细胞蛋白经DIGETM试剂盒的3重荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向电泳(2DE，Two-dimensionalElectrophoresis)。SDS-PAGE扫描后的图像使用ImageQuant软件进行分析，结果说明肝癌细胞蛋白提取液与该染料能相互兼容，样品得到了有效的标记，且蛋白量与荧光强度之间有较好的线性关系。2DE的扫描图像使用DeCyder5.0软件的DIA(DifferentialIn-gelAnalysis)和BVA(BiologicalVariationAnalysis)模式分析，结果说明Cy3和Cy5标记的蛋白质定量结果基本一致，但该染料标记肝癌细胞蛋白后会造成极少量蛋白如低分子量蛋白和极酸性极碱性蛋白出现位置偏差，给蛋白定量带来一定的误差，而BVA中的反标策略能够有效纠正这种由于不同荧光标记带来的定量误差。总之，我们对整个DIGE实验流程都进行了系统评价，标记实验和标记评价都获得了较好的结果，达到了满意的定量效果，提示该蛋白完全可以进行正式2D-DIGE实验。我们首次报道了用同一肝癌样品进行不同荧光标记后进行2DE的评估方法，该方法支持了DIGE体系定量的可靠性，而且能给出定量的误差范围，更进一步地完善了DIGE技术的评估体系，为DIGE技术平台的质量控制提供了很好的参考。
在肝癌细胞蛋白样品的2D-DIGE技术体系成熟之后，我们利用该技术结合生物质谱MALDI-TOF-TOF/MSMS比较了HBx基因在转染相应肝细胞系Changliver和HepG2细胞前后的差异，及HBV整合进细胞HepG2后的变化，并对部份蛋白进行了鉴定，以期探索HBX造成细胞癌变的机理。在p＜0.05、|ration|＞2时我们在以上三个比较组里分别找到了25、30、159个差异蛋白。统计分析后可以提出具体差异蛋白的蛋白点号，经比较发现在Changliver_HBX的差异点有8个可以在HBV组中找到，而HepG2_HBX组的差异点只有2个能在HBV组找到，这两个细胞系组别里只有1个共同的差异点，说明这两个细胞系本身的区别较之于HBx的转染后造成的区别更大。目前我们分别已鉴定了8、11、51个差异蛋白，分别涉及病毒细胞周期、糖代谢、氧化应激反应、细胞凋亡、信号转导等等。