透明颤菌血红蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及对其发酵特性的影响

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苏云金芽胞杆菌(Bt)在发酵过程中需要消耗大量氧气用以维持细胞正常代谢和杀虫蛋白的合成。透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种来源于原核生物的氧结合蛋白。本研究将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达于Bt中,通过提高细胞对氧气的利用能力,达到促进菌体生长和产物合成的目的。1.本研究构建了包含luxS启动子和vgb基因的整合载体pEG491-vgb+,利用该载体,将vgb基因整合到Bt菌株BMB171的染色体上,构建了菌株BMB171-VHb+。再将携带cry1Ac10基因的质粒pHT304-Kanr-cry转入BMB171-VHb+中,得到了菌株BMB667-VHb+。vgb和cry1Ac10基因在BMB667-VHb+中都得到了表达。同时构建了不表达VHb的对照菌株BMB667-VHb-。2.在高、中、低3种供氧条件的发酵实验中,BMB667-VHb+的细胞浓度(CFU)分别为对照菌株的0.94,1.23,和1.59倍;其晶体蛋白(ICP)产量分别为1.22,1.63和3.13倍;BMB667-VHb+的ICP产量最大值出现也比对照菌株提前4-8h。高、低两种装液量摇瓶发酵中,VHb表达菌株与对照相比,其对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫的LC50值分别下降了36.6%和10.0%。3.在临界氧浓度(COC)实验中,临界氧浓度最高出现在第4h;第4h时,BMB667-VHb+的COC为12%,较对照菌株COC18%下降了33%。发酵过程中,BMB667-VHb+最大摄氧率(OUR)值达到68.6 mmol/Lh;较对照菌株的最大OUR值39.6 mmol/Lh提高73%;BMB667-VHb+的最大呼吸强度(Qo2)为18.6mmol/gh与对照的呼吸强度14.8 mmol/gh相比,有20.4%的增长。在相同发酵条件下,VHb表达菌株和对照菌株分别摄取了通入氧气量的3.1%和2.2‰VHb的表达菌株比对照菌株多利用了41%的氧气。BMB667-VHb+和BMB667-VHb-的最大比生长速率分别为0.783h-1和0.801h~(-1),葡萄糖半饱和常数分别为0.272g/L和0.297g/L。4.本研究结果表明,vgb在Bt中表达以后,促进了菌数和晶体产量的增长,产物较菌数的增长明显,促进效果随着供氧条件的降低而增加。与氧代谢有关的菌株发酵特性也因vgb的表达而改变,COC、OUR和Qo2都得到提高,这些发酵特性的改变增强了菌株摄取氧气的能力。5.在利用浊度仪监测发酵罐菌体浓度实验中,首先得到消除搅拌和通气影响浊度值的的校正公式。然后建立了在稳定期以前,浊度值和细胞浓度的对应关系。利用有、无晶体两种Bt菌株发酵的比较,测定出单位菌体、芽胞、晶体对浊度值的影响比例为1、1.3、0.5。根据这一比例,可以监测到芽胞的形成,并能够判断芽胞形成比例,预测发酵结束时间。
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