植物细胞的显著特征之一是具有细胞壁。细胞壁的主要功能包括确定植物细胞形态、保护细胞和感受环境信号。细胞壁蛋白主要可以分为两大类,即细胞壁结构蛋白和细胞壁相关的酶类。目前,研究最多、含量最丰富的细胞壁结构蛋白主要有以下5类:伸展蛋白(extensin)或者是富含羟脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline-rich glycoprotein,HRGP),富含甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins,GRPs),富含脯氨酸蛋白(proline-rich proteins,PRPs),阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins,AGP),茄科凝集素(solanaceous lectins)。富含脯氨酸蛋白的表达都是发育阶段性和组织特异性的,它们的表达也受到病原菌感染和外界环境因素的影响。它们的功能被认为与对特定细胞类型初级细胞壁的构建有关,也可能在植物发育和防卫中起作用。本文所做的五个基因,GhPRP3、GhPRP4、GhPRP5、GhPRP6、GhPRP11是本课题组从棉花cDNA文库中根据序列同源性筛选分离出来的富含脯氨酸蛋白家族基因,分别具有369bp、408bp、582bp、876bp、648bp的开放阅读框,编码122、135、193、291、215个氨基酸的蛋白质。分离、鉴定这些基因,然后研究其功能,并弄清楚它们的表达调控具有重要的理论意义和应用价值。本实验从以下几个方面来研究这五个基因。 (1) 序列分析 所有5个GhPRPs在其N-末端1-30aa处都具有信号肽序列,在9-30aa处具有转膜区。对这五个PRP蛋白一级结构的分析发现,这几个蛋白Pro的含量分别为10.6%10.3%、18.0%、24.4%、34.9%,都含有较多的磷酸激酶C的磷酸化位点和几个(或者一个)N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)。因此,我们可以推测它们可能作为细胞壁中感应外界环境的信号分子而存在的。 序列同源性分析结果表明,GhPRP3-5氨基酸序列中含有8CM结构域(eight-cysteine motif),与许多植物PRP蛋白的同源性在30-70%之间。⑧硕士学位论文MASTER’5 THESISG人尸尺尸巧基因含有pollen ole e 1 aller罗n and extensin family protein结构区,与AtPRP、CaPRPI、NtPRP4、DcAGPI、PvPRPI蛋白的同源性都较高。GhPRPll与MsPRPI,AtPRPg蛋白具有较高的同源性。(2)基因表达初步分析 用改良的热酚法提取棉花发育早期各组织的RNA,利用RT一PCR的方法对其中四个基因的表达进行分析。然后,提取棉花不同组织的RNA,经转膜后,做Northem杂交分析。我们对与GhPRP3、GhPRP4、GhPRPS和GhPRI,6做RT一PCR分析,其结果与Northem杂交结果是一致的。Northem杂交分析结果显示G人月咫习在棉花叶子中表达最高,在花瓣中也有表达,而在其它组织中没有检测到此基因的表达,说明此基因的表达是叶子特异性的。GhPRP4、GhPRPS在棉花花瓣中表达最高,说明它们的表达具有花瓣特异性。该基因也在棉花根子叶、下胚轴、10 DPA胚珠、15 DPA胚珠中表达,此基因在10 DPA胚珠中表达仅次于花瓣。GhPRPS在棉花花瓣中表达最高,它也在子叶、下胚轴和10 DPA中表达,这个基因也是花瓣表达特异性的,它在花瓣中表达明显强于其他组织。 GhPRP巧在棉花组织中是广泛表达的,它在我所检测的几个组织中除了花瓣和花药外,其它组织中都或强或弱地表达。 万石只在棉花纤维中表达,而且,它的表达在10 DPA的纤维中表达最高。说明此基因表达是组织特异性和发育阶段性的。(3)载体构建与转化 利用DNA重组技术,将五个基因的阅读框插入到pBll21质粒中,构建了过量表达载体(overexpression veetor)。并进一步构建RN月载体(s uPPression vector)。PCR扩增反应及双酶消化证实目的基因已成功插入到载体中。目前已成功将这些载体转入到Agobacterinm LBA4404中,并且转化棉花。(4)Gh尸尺尸,基因全长序列和启动子序列的分析