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分段负义RNA病毒(sNSV)普遍通过“抓帽”机制合成含帽子结构的mRNA。在“抓帽”过程中,sNSV在帽子结构下游10-20碱基处切割寄主mRNA,获得“帽子序列”m7GpppN-NX(X=10-20),然后以m7GpppN-NX为引物,转录自身模板链,生成在5’端含一段异源“帽子序列”的病毒mRNA。
水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus, RSV)是一种重要的植物sNSV。最近,本实验室以高通量测序方式获取了染病水稻叶片中RSV mRNA的5’端序列,发现大量RSV mRNA结构为m7GpppN-NX(AC)n (n≥1)A1C2A3C4AAAGUC-,即它们在“帽子序列”与“转录序列”( 转录组模板链 3’-U1G2U3G4UUUCAG-,下划线部分)之间含一个或数个“额外 AC”(括号内的 AC)。这类 mRNA 在 RSV 毒义链(vRNA)的转录产物(如NP)中约占42%,而在互补链(vcRNA)的转录产物(如NCP)中约占 19%。结合文献中报道的相关模型,本实验室提出,RSV在“抓帽”过程中频繁使用“引发与重配”机制,且在转录vRNA时比在转录vcRNA时更频繁使用该机制。然而,除“引发与重配”机制外,“额外AC”的产生还有另外一种解释,即RSV频繁从自己的 mRNA 抓取“帽子序列”。如:m7GpppN-NxA1C2A3C4AAAGUC-为RSV的一个mRNA,RSV从该mRNA的C2处“抓帽”,会得到 m7GpppN-Nx(AC)A1C2A3C4AAAG-,再从后者的C2处“抓帽”,会得到m7GpppN-NxC(AC)2A1C2A3C4AAAGUC-。本研究利用以下两个实验来推测这一解释能否成立:
(1)研究“额外 AC”在 RSV 侵染早期的 mRNA 中的出现情况:以RSV摩擦接种本氏烟,分别在接种后的4、8、12、24和48小时从接种叶提取总RNA,以高通量测序手段分别测取各时间点RSV NP 和 NCP mRNA 的 5’端序列。若“额外 AC”主要来源于对自身mRNA 的 “ 抓 帽 ”, 我 们 可 以 预 见 : ① m7GpppN-NX(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在RSV侵染早期的mRNA中较为少见;② m7GpppN-NX(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在 NP mRNA 与 NCP mRNA中的占比在RSV侵染早期差别不大。
(2)跟踪“额外AC”在特定“帽子序列”引发的RSV mRNA中的出现情况:本实验室近期发现, RSV在本氏烟中能从瞬时表达的异源 mRNA 抓取“帽子序列”。基于这一现象,本研究以农杆菌注射的方式,在RSV系统侵染的本氏烟叶片表达一个 GFP mRNA,让RSV从该mRNA抓取帽子序列m7GpppN-ACGGGGGACTTC12。然后在1、2、3、5、9和12天研究m7GpppN-ACGGGGGACTTC12引发 的 RSV NP 和 NCP mRNA , 计 算 m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在各时间点的占比情况。若“额外AC”主要来源于对自身mRNA的“抓帽”,我们可以预见:① m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-占比 在 早 期 较 低 , 后 期 变 高 ; ②m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在 NP 和 NCP mRNA中的不同占比在后期更明显。
实验(1)所得结果表明:m7GpppN-NX(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在 RSV 侵染早期也十分普遍,且在侵染早期, m7GpppN-NX(AC)nACACAAAGUC-在NP mRNA(28.17-37.86%)中的占比也比在NCP mRNA(17.34-20.53%)中的占比高。 实验(2)所得结果表明:m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-的占比不随时间而明显改变;在农杆菌注射后的所有时间点, NP mRNA (38.97%-57.58%)都比NCP mRNA(0-16.30%)含更多的m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC) A1C2A3C4AAAGUC-。综合两个实验所得结果,本研究推断,RSV mRNA的“额外AC”主要来源于“引发与重配”机制,而不是对自身mRNA的“抓帽”。除此之外,本研究相关结果还表明:(1)RSV在摩擦接种到本氏烟4个小时后就已经开始转录;(2)在建立侵染的早期,RSV转录生成NCP mRNA的量远大于其转录生成NP mRNA的量。
水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus, RSV)是一种重要的植物sNSV。最近,本实验室以高通量测序方式获取了染病水稻叶片中RSV mRNA的5’端序列,发现大量RSV mRNA结构为m7GpppN-NX(AC)n (n≥1)A1C2A3C4AAAGUC-,即它们在“帽子序列”与“转录序列”( 转录组模板链 3’-U1G2U3G4UUUCAG-,下划线部分)之间含一个或数个“额外 AC”(括号内的 AC)。这类 mRNA 在 RSV 毒义链(vRNA)的转录产物(如NP)中约占42%,而在互补链(vcRNA)的转录产物(如NCP)中约占 19%。结合文献中报道的相关模型,本实验室提出,RSV在“抓帽”过程中频繁使用“引发与重配”机制,且在转录vRNA时比在转录vcRNA时更频繁使用该机制。然而,除“引发与重配”机制外,“额外AC”的产生还有另外一种解释,即RSV频繁从自己的 mRNA 抓取“帽子序列”。如:m7GpppN-NxA1C2A3C4AAAGUC-为RSV的一个mRNA,RSV从该mRNA的C2处“抓帽”,会得到 m7GpppN-Nx(AC)A1C2A3C4AAAG-,再从后者的C2处“抓帽”,会得到m7GpppN-NxC(AC)2A1C2A3C4AAAGUC-。本研究利用以下两个实验来推测这一解释能否成立:
(1)研究“额外 AC”在 RSV 侵染早期的 mRNA 中的出现情况:以RSV摩擦接种本氏烟,分别在接种后的4、8、12、24和48小时从接种叶提取总RNA,以高通量测序手段分别测取各时间点RSV NP 和 NCP mRNA 的 5’端序列。若“额外 AC”主要来源于对自身mRNA 的 “ 抓 帽 ”, 我 们 可 以 预 见 : ① m7GpppN-NX(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在RSV侵染早期的mRNA中较为少见;② m7GpppN-NX(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在 NP mRNA 与 NCP mRNA中的占比在RSV侵染早期差别不大。
(2)跟踪“额外AC”在特定“帽子序列”引发的RSV mRNA中的出现情况:本实验室近期发现, RSV在本氏烟中能从瞬时表达的异源 mRNA 抓取“帽子序列”。基于这一现象,本研究以农杆菌注射的方式,在RSV系统侵染的本氏烟叶片表达一个 GFP mRNA,让RSV从该mRNA抓取帽子序列m7GpppN-ACGGGGGACTTC12。然后在1、2、3、5、9和12天研究m7GpppN-ACGGGGGACTTC12引发 的 RSV NP 和 NCP mRNA , 计 算 m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在各时间点的占比情况。若“额外AC”主要来源于对自身mRNA的“抓帽”,我们可以预见:① m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-占比 在 早 期 较 低 , 后 期 变 高 ; ②m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在 NP 和 NCP mRNA中的不同占比在后期更明显。
实验(1)所得结果表明:m7GpppN-NX(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-在 RSV 侵染早期也十分普遍,且在侵染早期, m7GpppN-NX(AC)nACACAAAGUC-在NP mRNA(28.17-37.86%)中的占比也比在NCP mRNA(17.34-20.53%)中的占比高。 实验(2)所得结果表明:m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC)nA1C2A3C4AAAGUC-的占比不随时间而明显改变;在农杆菌注射后的所有时间点, NP mRNA (38.97%-57.58%)都比NCP mRNA(0-16.30%)含更多的m7GpppN-ACGGGGGACTTC12(AC) A1C2A3C4AAAGUC-。综合两个实验所得结果,本研究推断,RSV mRNA的“额外AC”主要来源于“引发与重配”机制,而不是对自身mRNA的“抓帽”。除此之外,本研究相关结果还表明:(1)RSV在摩擦接种到本氏烟4个小时后就已经开始转录;(2)在建立侵染的早期,RSV转录生成NCP mRNA的量远大于其转录生成NP mRNA的量。