【摘 要】
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目的:遗传性多发性骨软骨瘤（Hereditary Multiple Exostoses,HME）是一种常染色体显性遗传病,常导致患者身材矮小和骨骼畸形,其主要致病基因为EXT1,但目前HME的发病机理和机制仍不清楚。本研究基于CRISPR/Cas9技术构建了Ext1+/-基因敲除小鼠模型,以探索EXT1基因的更多生物学功能,同时为研究HME发病机理,发现药物新靶点等生物医学研究提供理论依据。方法:
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目的:遗传性多发性骨软骨瘤（Hereditary Multiple Exostoses,HME）是一种常染色体显性遗传病,常导致患者身材矮小和骨骼畸形,其主要致病基因为EXT1,但目前HME的发病机理和机制仍不清楚。本研究基于CRISPR/Cas9技术构建了Ext1+/-基因敲除小鼠模型,以探索EXT1基因的更多生物学功能,同时为研究HME发病机理,发现药物新靶点等生物医学研究提供理论依据。方法:靶向小鼠Ext1基因设计了两条sg RNA,对原核时期受精卵胞质注射sg RNA和Cas9蛋白,经胚胎移植后获得F0代Ext1基因敲除小鼠,扩繁后对F2代Ext1+/-基因杂合突变小鼠进行表型鉴定。通过q PCR、WB和IHC等实验检测Ext1+/-基因敲除小鼠Ext1基因的表达水平,X-ray分析Ext1+/-基因敲除小鼠骨骼的形态特征,膝关节病理切片检测关节软骨发育情况,同时对Ext1+/-基因敲除小鼠和野生型小鼠的体重和体长进行记录。结果:我们获得了两只F0代Ext1基因敲除小鼠,经过繁育得到了Ext1基因杂合缺失46 bp且能稳定遗传的小鼠品系。Ext1+/-基因敲除小鼠Ext1m RNA的表达水平明显低于野生型小鼠,肝脏和膝关节中蛋白表达水平与野生型小鼠相比无统计学差异,但IHC实验表明Ext1+/-基因敲除小鼠的膝关节软骨细胞中EXT1蛋白的含量低于野生型小鼠。HE染色发现Ext1+/-基因敲除小鼠心脏、肝脏、肺、肾脏和膝关节等组织形态结构正常。X-ray分析发现有14只雄性Ext1+/-基因敲除小鼠在尾椎附近出现异常显影,CT值为200 Hu左右。此外Ext1+/-基因敲除小鼠的体重低于野生型小鼠,体长无显著差异。结论:本研究成功构建了Ext1+/-基因敲除小鼠模型,Ext1+/-基因敲除小鼠的体重低于野生型小鼠。未在Ext1+/-基因敲除小鼠骨骼中发现骨软骨瘤,但在Ext1+/-基因敲除小鼠中出现了雄性性别依赖的异常显影,其CT值介于小鼠肋骨与脊柱之间,表明出现了骨发育异常现象。
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