背景和目的神经系统退行性疾病,是一组由慢性进行性中枢神经组织退行性变性而产生的疾病总称,它包括：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、亨廷顿病(Huntington disease, HD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)等。迄今为止,此类疾病的发病病因及发病机制尚未完全阐明,随着老龄化社会的来临,神经系统退行性疾病中AD和PD患病率呈逐年上升趋势,虽然其具体发病机制目前尚不能明确,但有研究表明,AD和PD的发生发展有着共同的氧化应激损伤通道,从而造成生物大分子物质氧化损伤,并最终导致细胞凋亡,氧化应激在AD、PD发生发展中起着重要作用。在神经系统退行性疾病治疗方面,传统的药物治疗方法,副作用大,费用高,易产生耐药性,长期服药效果下降,近年来,大量的研究证明,很多中药均有清除自由基的功效,能够抑制氧化应激所带来的一系列的损伤及其继发的细胞凋亡,尤其在治疗AD、PD方面取得了显著的成绩,今后中药在阻止或延缓AD、PD发生、发展,以及预防和治疗AD、PD中会起着一定的积极作用。本研究旨在研究和探讨白蚁菌圃及中药等,其抗氧化、治疗神经系统退行性疾病的机制和效果,为开发新的治疗神经系统退行性疾病的药物提供理论依据。研究方法1.利用N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)给大鼠腹腔注射,再用爬杆法进行筛选,选取PD模型大鼠随机抽取治疗组及对照组,由黄芪、天麻、银杏叶、白芍、钩藤、连翘、生甘草、野生葛根、大叶红景天、黄连等配成中药平颤方,联合褪黑素(MT)给予模型组及对照组进行治疗21d,观察大鼠的行为学及脑切片,分别用H-E染色,Bax/Bcl-2免疫组织化学染色和TUNEL法细胞凋亡染色,对脑匀浆进行多巴胺(dopamine, DA)及高香草酸(homovanillic acid, HVA)和二羟基苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid, DOPAC)的测定。2.利用野生型果蝇(UAS-wild-type a-synuclein/+)及UAS-DdC果蝇杂交得到PD果蝇,以野生型果蝇为对照组和PD果蝇作为研究组,给予不同浓度的白蚁菌圃醇提液培养42d,并对培养前后PD果蝇的行为学及寿命进行分析、对果蝇脑组织病理切片苏木精-伊红(HE)染色后观察。3.利用D-半乳糖持续皮下注射建立小鼠AD模型的,作为实验组,正常小鼠作为对照组,采用Morris水迷宫定位航行实验,分别从四个象限将小鼠放入水池中,计算潜伏期平均值,以评价小鼠空间记忆的获得能力,并对模型实验组小鼠血液进行过氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)的测定,评价造模是否成功,给予模型组小鼠喂食不同浓度的白蚁菌圃醇提液,同时测定AD模型治疗组小鼠血液的SOD,MDA和GSH水平,评价不同浓度白蚁菌圃醇提液对AD小鼠的治疗效果,并分别观察比较AD模型组与治疗组的小鼠脑部p-淀粉样蛋白表达、脑组织和肝组织病理学改变。4.白蚁菌圃醇提液对抗SH-SY5Y细胞氧化应激损伤作用的研究,用H202建立人神经瘤母细胞SH-SY5Y氧化应激损伤模型,MTT法测不同时间段的细胞存活率,同时收集各组细胞培养液用于检测SOD、MDA和GSH,在造模同时和造模后加入不同浓度的白蚁菌圃醇提取液,观察其对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的预防及治疗作用。5.白蚁菌圃水提液对胃癌细胞系BGC-823细胞生长的影响,应用白蚁菌圃水提液与BGC-823细胞作用24h后,于倒置显微镜下观察细胞形态的变化,台盼蓝染色法测细胞存活率,MTT比色法检测细胞活性,取对数期生长的BGC-823细胞,同时设空白对照组,流式细胞仪检测细胞凋亡,并行细胞总RNA的提取,cDNA逆转录,荧光定量PCR,设计引物,扩增。结果1.MPTP复制的PD动物模型,其前脑组织DA、HVA、DOPAC含量与空白对照组相比,均显著降低,同时伴随有智力减退和运动障碍；使用中药平颤方+MT治疗21d,模型组中DA、HVA、DOPAC含量均较病理对照组明显增加；给予中药平颤方联合MT治疗PD,大鼠前脑纹状体神经元和胶质细胞Bcl-2基因蛋白的表达明显增多、增强,Bax基因表达受到抑制,同时DA细胞凋亡减少。2.与对照组相比,PD雄性果蝇的攀爬能力随年龄成熟而增强,但在羽化后的24到48d,下降较明显。在白蚁菌圃实验组中,白蚁菌圃干预并起作用的时间和浓度相关,在雌性果蝇中,PD果蝇的攀爬能力随着年龄的增长而逐渐降低,不同浓度的白蚁菌圃培养都能提高PD果蝇的攀爬能力,在羽化后18到48d最显著,且随浓度及果蝇年龄的增长,效果更好,雌雄PD果蝇之间攀爬能力无明显差异,且用含不同浓度的白蚁菌圃醇提液培养基饲养的果蝇寿命明显延长,呈现了较好的剂量依赖性关系。取攀爬能力下降较明显的第36d的果蝇,制作病理切片,经HE染色的病理切片可见,与对照组相比,PD果蝇的脑组织边缘皮质层细胞变薄、排列紊乱,空泡增多,添食了白蚁菌圃提取物的果蝇脑组织中,细胞数目增多,排列较紧密有序,空泡减少。3.在AD衰老模型组迷宫试验中,小鼠体力、智力下降,逃避潜伏期延长明显,其氧化和抗氧化指标明显改变,且AD模型组脑部改变与衰老的生理变化相符合,与相关文献报道一致,证明造模成功。治疗组中,小鼠血液SOD活力、GSH含量、MDA含量较模型组有明显改善,不同浓度白蚁菌圃治疗后AD模型组脑细胞、肝细胞中,细胞形态随着药物治疗浓度的增加,绝大多数细胞形态逐渐接近正常,且治疗组脑组织绝大多数细胞中,β-淀粉样蛋白表达逐渐接近正常组小鼠脑组织。4.在神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞的培养液中加入不同剂量的白蚁菌圃醇提液,通过SOD、MDA及GSH测定结果表明,白蚁菌圃醇提液预先处理细胞,可以对抗H202诱导的SH-SY5Y细胞的损伤,存活率提高,表明白蚁菌圃醇提取液可以对抗H202造成的损伤。5.白蚁菌圃水提液与胃癌细胞系BGC-823细胞作用24h后,结果显示,加药后BGC-823细胞的生长受到抑制,细胞的数量和形态都发生了改变,细胞数目减少,部分细胞破裂,另有部分细胞的核皱缩,核浆变少等,表明白蚁菌圃水提液能破坏和抑制BGC-823细胞的生长,对BGC-823细胞的存活率有较大影响,细胞的存活率与浓度呈负性相关,同时发现白蚁菌圃提取物可以引起p53基因表达的上调,但其机理有待研究。结论1.MPTP注射建模显示,模型组绝大多数小鼠鼠须脱落明显,毛色逐渐失去光泽,易脱落,皮肤弹性差,呈现出衰老体征,表明AD模型成功建立,中药副作用小,可以和西药配伍,从而增加治疗的效果减少耐药性,模型实验组中药治疗后,衰老症状、行为学及脑部组织病变等均有改善,褪黑激素分子小,作用部位广泛,以其高弥散的穿透能力发挥生物学效应,通过提高脑的抗氧化能力,防止脑组织免受自身氧化应激损伤。中西药二者联合使用,有机联系辨证论治的统性和证候之间的关系,为探索中医或中西医结合治疗PD的优势及其作用机制提供了理论基础。2.果蝇具有高度发达的神经系统、较短的生命周期,并且易于进行细胞生物学、遗传学、分子生物学研究的操作和分析,是一个非常稳定而实用的模式生物,果蝇PD模型能够很好的模拟人类PD的慢性退行性改变。白蚁菌圃对PD果蝇的攀爬能力及寿命有较明显的改善,且呈现较好的浓度和时间依赖性,雌性和雄性之间无明显差异,经白蚁菌圃治疗后的PD果蝇,其脑组织边缘皮质层细胞较PD模型组增多,且排列整齐,脑组织内的空泡减少,此改变与果蝇的攀爬能力和寿命的改变相一致,由此可以证明白蚁菌圃可以改善PD的运动障碍,可能与白蚁菌圃抗氧化作用相关,其神经保护作用及抗PD的作用机制,仍需进一步研究,因其较强的抗氧化作用,白蚁菌圃有望发展成为一种预防和治疗PD的新型药物。3.在实验中,利用D-半乳糖持续皮下注射建立小鼠AD模型可靠,经不同浓度白蚁菌圃治疗后,氧化抗氧化指标及肝组织、脑组织形态改变、脑组织中β-淀粉样蛋白表达减少,随着治疗浓度的增加,改变呈现浓度依赖性,显示高浓度治疗剂量效果更佳,说明白蚁菌圃具有抗AD的作用。4.以H202体外诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的模型,可以比较直观地分析抗氧化剂对细胞的保护作用,预先加入白蚁菌圃醇提取液处理细胞,说明白蚁菌圃醇提取液具有一定的预防H202对SH-SY5Y细胞的损伤作用。当白蚁菌圃醇提取液与H202同时处理细胞时,细胞的存活率比H202损伤对照组仍有提高,并与剂量呈正向趋势,说明在白蚁菌圃醇提取液中存在抗氧化的物质,推论白蚁菌圃具有抗氧化的作用,可能与其高含量的黄酮总甙有关,但其起作用的主要成分尚不清楚,需进一步检测。5.实验研究结果表明,白蚁菌圃对胃癌细胞BGC-823具有一定的促凋亡作用,但具体机制尚不清楚,有待深入研究。