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一、研究背景硬皮病是一种伴随微血管损伤和组织器官纤维化的自体免疫性疾病,分为系统性硬皮症和局限性硬皮症1、局限性硬皮病主要局限于皮肤增厚,较少累及内脏器官2。已有研究表明,α-SMA、collagen、炎症因子、免疫系统的激活和血管的病变在局限性硬皮病中发挥着关键的作用3。胞内多条信号通路如:NF-κB和MAPK信号通路的激活可促使炎症反应及引起严重的纤维化4。蛋白激酶D是一种新的丝氨酸/苏氨酸激酶和甘油二酯(DAG)受体蛋白家族,包括PKD1、PKD2和PKD3三种亚型5。Mohammad Rashel等人在皮肤研究中表明蛋白激酶D可以刺激角质细胞分化,这提示表皮适应性反应具有潜在的促增殖作用6,7。但蛋白激酶D在硬皮病中的作用并不明确。二、研究目的有研究显示,PKD2可导致过度增生性皮肤病8,但其在局限性硬皮病中的作用并不明确。本文通过利用PKD2突变型敲入(knock-in,KI)小鼠模型,探讨PKD2在BLM诱导小鼠局限性硬皮症中的作用及其机制。三、研究方法我们用PKD2WT/SSAA-KI小鼠成功地繁育PKD2SSAA/SSAA-KI小鼠(PKD2催化活性缺失的小鼠)。PKD2WT/WT和PKD2SSAA/SSAA-KI小鼠随机的分为四组:PKD2WT/WT PBS、PKD2WT/WT BLM、PKD2SSAA/SSAA-KIPBS 和 PKD2SSAA/SSAA-KI BLM,每组小鼠皮下注射100μL 1xPBS或BLM(1mg/mL),持续28天使得造模完成,取材。对皮肤组织做组织切片H&E染色和Masson染色观察皮肤组织内部形态学变化,同时也通过western blot和RT-qPCR检测相关生物标志物和PKD2调控的信号通路。四、研究结果我们用PCR鉴定出PKD2WT/WT小鼠具有236-bp的PCR产物;PKD2SSAA/SSAA-KI 小鼠具有 344-bp 的 PCR 产物;PKD2WT/SSAA-KI 小鼠具有236-bp 和 344-bp 的 PCR 产物。染色结果显示,与PKD2WT/WT PBS相比,PKD2WT/WTBLM组小鼠真皮层厚度是其两倍,并且具有统计学意义,但是,这种现象在PKD2SSAA/SSAA-KI小鼠中没有明显的体现。与PKD2WT/WT PBS小鼠相比,PKD2SSAA/SSAA-KI小鼠皮肤组织胶原纤维染色较浅。与PKD2WT/WT BLM组小鼠相比,PKD2SSAA/SSAA-KI小鼠在BLM诱导下,胶原纤维呈现表达增加的现象几乎是没有,这意味着PKD2在BLM诱导胶原纤维表达中起着重要作用。同时,与PKD2WT/WT PBS组相比,PKD2SSAA/SSAA-KIPBS组小鼠可以明显下调α-SMA、collagen Ⅰ-α2的表达,提示PKD2参与调节collagen Ⅰ-α2蛋白的表达。同时,PKD2催化活性缺失也可以明显下调博来霉素诱导的a-SMA,collagen Ⅰ,collagen Ⅳ-α1,collagen Ⅳ-α2,TGF-β1 和 IL-6 的 mRNA 表达。此外,我们通过Western blot分析STAT3及其磷酸化位点Tyr705活性变化。与PKD2WT/WT BLM组相比,PKD2SSAA/SSAA-KIBLM组中STAT3蛋白的表达量没有变化,但在其磷酸化Tyr705位点的表达是明显降低的。五、结论本研究结果表明PKD2在BLM诱导的小鼠局限性硬皮症中起着关键作用,PKD2的催化活性抑制可抵抗BLM诱导的小鼠局限性硬皮症,减小真皮层厚度、α-SMA、collagen的表达及相关炎症因子的产生。