阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种常见的中枢神经系统(central nervous system,CNS)慢性神经退行性疾病,临床上主要表现为进行性记忆衰退、高级认知功能障碍及运动能力受损,其病理学特征包括神经元外主要由聚集的β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)组成的老年斑(senile plaques,SPs)和细胞内含高度磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs),以及营养不良突起、广泛的神经元丢失和神经胶质增生。　　AD的发病机制迄今尚不十分清楚,但从上世纪90年代至今,以Aβ过度积聚为核心的Aβ学说一直占据着AD发病机制及新药研究的主流方向,为攻克AD这一顽症带来了曙光。然而,迄今为止,美国FDA批准用于AD治疗的药物仅有两类,即胆碱脂酶抑制剂(cholinesterase inhibitors,ChEIs)和NMDA受体(N-methyld-D-aspartate receptor,NMDA receptor)拮抗剂,只能改善症状,却不能延缓或阻断疾病进展。而以抑制Aβ产生、沉积或促进Aβ清除为主的药物被认为可通过中止或逆转AD病理改变而起到根本的治疗作用,因而是目前抗AD药物研究开发领域的热点和主要攻关方向。β-分泌酶(β-site APP cleaving enzyme1,BACE1)是催化裂解淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)生成Aβ的重要限速酶。已有研究表明, BACE1基因敲除的小鼠脑内无Aβ产生,但生活基本正常,表明可以通过抑制BACE1而阻断或降低 Aβ的产生来治疗 AD,且不会带来明显的不良反应,因而BACE1被认为是开发AD治疗药物的相对理想靶标,其抑制剂的开发已成为药物开发的热点。　　本研究建立了包括体外分子水平、细胞水平及整体动物水平在内的系统的β-分泌酶抑制剂筛选与评价体系,并对本所七室设计合成的一系列新结构化合物及本室前期从中药复方中提取的活性组分或成分进行了筛选,为基于抑制β-分泌酶活性的抗 AD药物的研究开发奠定了基础。　　第一部分β-分泌酶抑制剂筛选与评价体系的建立　　一、体外分子水平β-分泌酶抑制剂高通量筛选体系的建立　　体外分子水平主要考察待测样品对BACE1活性的抑制作用。1.体外分子水平β-分泌酶抑制剂高通量筛选体系的建立　　采用均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)法建立了β-分泌酶抑制剂高通量筛选体系,方法参数确定为:反应总体积为42μL,包括:15μL BACE1反应液(0.67 mU/μL)、15μL BACE1底物反应液(400 nmol/L)、2μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)/待测样品(或阳性对照)、10μL终止液;反应时间为6hr、BACE1浓度为0.67 mU/μL,采用VICTOR3酶标仪测得其信噪比(signal-to-noise ratio,S/N)为649.6,信背比(signal-to-background ratio,S/B)为44.6,Z’因子为0.91,变异系数(Coefficient of Variation,CV)小于10％。　　2.体外分子水平β-分泌酶抑制剂高通量筛选体系的验证　　以文献公开发表的BACE1抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin gallate,EGCG)验证所建立的高通量筛选体系,采用VICTOR3多功能酶标仪所测得EGCG抑制BACE1的半数抑制浓度(50％inhibitory concentration,IC50)为7.57×10-7 M,与文献报道一致,而FLUOstar OPTIMA多功能酶标仪检测结果无法拟合出 EGCG对BACE1的IC50。因此,在后续研究中,确定初筛时采用EGCG为阳性对照药,并使用VICTOR3多功能酶标仪进行检测。　　二、细胞水平β-分泌酶抑制剂筛选与评价体系的建立　　在细胞水平对所得活性化合物进一步筛选主要从两方面进行,一是测定化合物在细胞水平对β-分泌酶活性的影响,二是测定化合物对细胞Aβ分泌水平的影响。　　1.基于β-分泌酶活性测定的筛选方法的建立　　本研究分别采用FRET法和TRF法通过考察蛋白用量及检测时间,建立了细胞内源β-分泌酶活性检测方法。结果表明,TRF法和FRET法均可用于内源性β-分泌酶活性检测,TRF法本身检测下限低于FRET法,且检测时间更灵活,但用于内源β-分泌酶活性检测时TRF法检测下限不及FRET法。　　2.基于Aβ分泌水平测定的筛选方法的建立　　为进一步评价筛选获得的具有抑制BACE1活性的化合物对细胞Aβ分泌的影响,本研究建立了细胞水平的Aβ检测方法。　　采用AlphaLISA法建立基于细胞Aβ分泌水平测定的筛选方法,该法检测限为0.1-100ng/mL;将体系中受体微珠、供体微珠和待测样品(及标准品)用量减半后相同样品Aβ1-40浓度检测结果与原体系一致,因而体系减半后可在保证检测准确性和灵敏度的前提下进一步提高其通量,从而极大地降低实验成本。　　三、动物水平β-分泌酶抑制剂筛选与评价体系的建立　　为了探讨快速老化模型小鼠(senescence-accelerated mouse,SAM)脑内β-分泌酶活性的变化及其与Cat D、Cat B活性的关系,进而采用该模型进行β-分泌酶抑制剂的筛选与评价,本研究首先观察了增龄过程中快速老化模型小鼠亚系(SAM-prone/8,SAMP8)和抗快速老化模型小鼠亚系(SAM-resistant/1,SAMR1)海马和皮层内β-分泌酶、Cat D和Cat B活性的动态变化,并采用实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技术对其mRNA的表达进行了观察。　　1.SAM增龄过程中脑内β-分泌酶、Cat D和Cat B活性变化　　1.1β-分泌酶活性　　采用FRET法检测SAM皮层内源β-分泌酶活性时,蛋白样品用量为0.125～0.5μg,检测时间为1～2hr。　　研究结果表明,SAMR1和SAMP8皮层β-分泌酶活性皆随增龄而升高,但品系间无明显差异。　　与2月龄相比,SAMR1与SAMP8海马β-分泌酶活性均显著升高后明显降低,且6月龄和12月龄SAMP8海马β-分泌酶活性明显高于同月龄SAMR1。　　1.2 Cat D和Cat B活性　　采用FRET法建立SAM皮层组织蛋白酶D(Cathepsin D,Cat D)和组织蛋白酶B(Cathepsin B,Cat B)活性检测的方法,结果表明,组织蛋白样品用量均为3.13～50μg,检测时间拟选用1-2hr。　　SAMR1皮层Cat D活性随增龄无明显变化;SAMP8皮层Cat D活性随增龄显著升高;但品系间无明显差异。而SAMR1与SAMP8海马Cat D活性随增龄增加无明显变化且品系间无显著差异。　　SAMR1与SAMP8大脑皮层及海马Cat B活性随月龄增加均无明显变化,且品系间无显著差异。　　相关性分析表明,SAM脑内Cat B活性随增龄变化与β-分泌酶活性相关性较小,Cat D活性随增龄变化与β-分泌酶活性显著相关。　　2.SAM增龄过程中其脑内BACE1、Cat D和Cat B的mRNA表达变化　　本研究采用RT Q-PCR技术对2、6、12月龄雄性SAMR1和SAMP8大脑皮层和海马BACE1、Cat D和Cat B的mRNA表达情况进行了检测,结果如下:　　2.1 BACE1 mRNA表达　　SAMR1和SAMP8大脑皮层中BACE1 mRNA表达随月龄增加无显著变化。SAMR1海马中BACE1 mRNA表达水平随月龄增加显著降低,而SAMP8海马中BACE1 mRNA表达水平随月龄增加无明显变化;12月龄SAMP8海马BACE1 mRNA表达水平显著高于同月龄SAMR1。　　2.2 Cat D mRNA表达　　SAMR1和SAMP8大脑皮层Cat D mRNA的表达随月龄增加无明显变化,但2月龄SAMP8显著高于同月龄SAMR1;SAMR1海马Cat D mRNA表达随月龄增加显著降低, SAMP8海马Cat D mRNA表达随月龄增加无明显变化,且品系间无显著差异。　　2.3 Cat B mRNA表达　　SAMR1和SAMP8大脑皮层Cat B mRNA表达水平随月龄增加无明显变化,但2和6月龄SAMP8明显高于同月龄SAMR1;SAMR1 Cat B mRNA表达水平随月龄增加显著降低, SAMP8海马Cat B mRNA表达水平随月龄增加无明显变化,且品系间无显著差异。　　第二部分β-分泌酶抑制剂的筛选　　一、GSY系列化合物的筛选　　采用所建立的β-分泌酶抑制剂筛选体系从GSY系列10个化合物中发现了4个IC50不超过10-6M的化合物,其中2个化合物IC50不超过10-9M,目前正在进行细胞水平筛选与评价。　　二、H系列化合物的筛选　　采用所建立的β-分泌酶抑制剂筛选体系从H系列103个化合物中发现了6个IC50不超过10-6M的化合物;进而采用改进的HTRF法对H系列3个化合物即H1712、H0412、H0312的筛选结果进行了排除,并选择公开发表的BACE1抑制剂EGCG和化合物3以及活性化合物013和015作为参照。结果显示,H1712、H0412、H0312本身具有较强荧光淬灭作用,对BACE1抑制作用很可能为假阳性结果,且EGCG对BACE1的抑制作用也可能由于荧光淬灭作用所致;而化合物013和015及阳性化合物3对BACE1活性具有明显抑制作用。　　三、拟肽类化合物的筛选　　对32个拟肽类化合物进行了筛选,化合物浓度为10-6M时对BACE1活性抑制率未超过50％,表明该系列化合物对BACE1无明显抑制作用。　　四、中药复方与组分的筛选　　对当归芍药散和其活性部位 JD30及其活性成分之一芍药苷进行了筛选,结果发现当归芍药散和JD30对BACE1抑制作用量效关系良好,而其活性成分芍药苷对BACE1活性没有影响。　　五、其他化合物的筛选　　对其他8个化合物进行了筛选,化合物浓度为10-6M时对BACE1最高抑制率不超过10％,表明这些化合物对BACE1无明显抑制作用。　　总之,本研究建立了包括分子、细胞及动物水平在内的系统的β-分泌酶抑制剂筛选与评价体系,并在分子水平完成了156个待测样品的筛选;本研究结果一方面为揭示SAMP8脑内Aβ沉积的分子机制提供了新的实验依据,佐证了SAMP8是一个研究AD发病机制和用于评价AD药物的合适模型;另一方面为以β-分泌酶为靶标的防治AD药物的研究奠定了坚实的基础,具有一定的理论意义和良好的应用前景。