第一部分川崎病B10细胞数量及功能的研究背景:川崎病（KD）是一种儿童急性系统性血管炎症,已发现单核细胞过度活化是其发病的重要环节,但具体机制尚未完全阐明。调节性B细胞（Bregs）是一类不依赖分泌免疫球蛋白且具有免疫调节功能的B细胞,IL-10对于其发挥负性调节作用必不可少,故以功能命名为“B10”细胞。研究已发现B10细胞在多种疾病发病机制中扮演重要角色,但在川崎病中的作用却尚未完全阐明。目的:本研究通过检测KD患者急性和缓解期B细胞不同亚群IL-10表达,分析疾病不同阶段B细胞分化为B10的能力,并进一步评估B10细胞对单核细胞功能的抑制作用,旨在探索川崎病负调控异常的原因,初步阐明单核细胞过度活化的发病机制。方法:选取深圳市儿童医院住院KD患儿23例,根据有无冠状动脉损害分为有冠状动脉损害组(KD^CAL+)和无冠状动脉损害组(KD^CAL-)。同年龄健康儿童33例为对照组（Ctrl）。流式细胞术检测外周血总B细胞（CD19⁺）、过渡B细胞(CD19⁺CD24^hii CD38^hi)、初始B细胞(CD19⁺CD27^-CD24^intCD38^int)和记忆B细胞(CD19⁺CD24^hiCD27⁺)胞内IL-10表达水平。免疫磁珠阴性分选CD19⁺B细胞及CD14⁺单核细胞。Real-time PCR检测B细胞IL-10 mRNA表达。CpG和sCD40L体外诱导B细胞IL-10表达,再与单核吞噬细胞共培养,流式检测CD14⁺单核细胞胞内TNF-α表达水平。通过公式[1-（共培养体系中单核细胞胞内TNF-α表达/单独培养单核细胞内TNF-α表达）×100)]计算抑制率。采用IBM SPSS version 20.0 Windows软件进行统计分析。使用Kolmogorov-Simonov检验来评估数据的正态分布。组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:（1）KD患儿23例,男13例,女10例;年龄6-107月,平均（39.43±25.38）月。KD^CAL+13例（56.5%）,KD^CAL-10例（43.5%）,临床表现主要包括:发热持续时间7.48±1.93（5–13）天,皮疹（95.7%）,淋巴结肿大（87.0%）,结膜充血（100.0%）,口唇粘膜病变（100.0%）,关节炎（13.0%）,手足脱皮（69.6%）,脓尿（43.5%）,黄疸（13.0%）及血小板增高（82.6%）。（2）四组B细胞群体均表达IL-10;过渡性和记忆性B细胞产生IL-10水平高于初始B细胞。（3）KD急性期,各B细胞亚群IL-10表达均呈下降趋势,记忆B细胞中尤为明显（P<0.05）。IVIG治疗后,各B细胞亚群IL-10表达部分恢复;其中总B细胞IL-10表达差异有统计学意义（P<0.05）。（4）与Ctrl和KD^CAL-组相比,KD^CAL+组IL-10表达降低更为明显。（5）与Ctrl相比,KD急性期B细胞IL-10mRNA表达水平明显下降（P<0.05）;IVIG治疗后,其表达水平较急性期部分恢复（P=0.061）。（6）KD组患儿外周血单核细胞胞内TNF-α表达明显高于Ctrl（P<0.05）;比较自体诱导B10细胞对单核细胞胞内TNF-α表达的抑制率,KD组较Ctrl组降低四倍（P<0.05）。（7）分别将KD组及Ctrl组诱导B10细胞与正常儿童单核细胞进行混合培养,与Ctrl组B10细胞混合培养的单核细胞胞内TNF-α水平较与KD组混合培养的单核细胞明显降低（P<0.05）。结论:（1）不同分化阶段B细胞均有分泌IL-10的潜力,这种能力随疾病状态而改变;（2）以单一分化阶段B细胞代表调节性B细胞并不恰当,而以IL-10等功能因子界定B细胞的免疫调节功能更为合适。（3）KD患儿急性期B10细胞数量及功能均受损,其负调节能力下降。第二部分川崎病B10细胞micro RNA调控机制研究背景:IL-10是一种关键负性调节细胞因子,来自多种不同细胞类型,对其表达调控一直是研究重点。最近研究表明,IL-10和mi RNAs之间存在重要相互作用。mi RNAs调控IL-10已被证实在自身免疫和炎症性疾病中发挥重要作用。但以上研究大多基于单核吞噬细胞和T细胞,对于B细胞IL-10表达的mi RNAs调控却尚乏系统研究。目的:本项目利用具有高炎症反应特点的KD疾病模型,对B10细胞mi RNAs调控机制进行系统研究,深入解析该疾病B10细胞负调控异常的原因及其与单核细胞过度炎症反应的关系,为阐明川崎病发病机制提供新的理论基础,以及疾病早期干预筛选新的治疗靶点。方法:免疫磁珠阴性分选CD19+B细胞及CD14+单核细胞。流式检测单核细胞胞内TNF-α蛋白表达水平。Real-time PCR检测B细胞miRNAs表达,包括:mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p和mi R-142-3p/5p表达。通过多变量分析,确定IL-10表达（因变量）与mi RNAs表达（自变量）之间的关系。通过计算Pearsons（正态数据分布）或Spearmans（非正态数据分布）相关系数,初步探讨IL-10与mi RNAs之间可能的联系。采用多元线性回归分析筛选影响IL-10表达的关键mi RNA。应用多元逐步回归分析确定最佳回归方程（纳入标准P<0.05;排除标准P>0.1）。利用RNA递载材料PEI将Agomir-27-3p-FAM（Mimic）或Antagomir-27-3p-FAM（Inhibitor）,及其相应阴性对照（NC）转染至外周血B细胞。激光共聚焦显微镜检测荧光标记mi RNAs细胞内定位,流式检测转染效率及胞内IL-10表达。采用Cp G+s CD40L诱导培养B10细胞。ELISA检测诱导B10细胞培养上清IL-10表达。将转染及诱导B10细胞与CD14+单核细胞共培养,观察转染后B10细胞对单核细胞TNF-α产生的抑制作用。流式检测单核细胞胞内IL-10表达及Real-time PCR检测单核细胞mi R-27a-3p表达。结果:（1）KD急性期mi R-98-5p/3p、mi R-21-5p、let7b-5p、mi R-27a-3p表达均明显高于对照组;IVIG治疗后,除let7b-5p外,其余mi RNAs表达均下调（P<0.05）。KDCAL+组mi R-98-5p、mi R-27a-3p表达增加更显著,而KDCAL-组mi R-21-5p、mi R-98-3p表达增加更显著（P<0.05）。mi R-142-3p/5p在KD急性期表达水平较对照组降低（P<0.05）。mi R-106a表达水平无明显变化。（2）选取疾病不同阶段表达变化差异显著的micro RNAs作为自变量（mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p,mi R-142-3p/5p）,IL-10作为因变量。多因素分析结果显示:IL-10 m RNA及蛋白表达都与mi R-27a-3p表达呈负相关（r=-0.599,P<0.05;r=-0.667,P<0.05）,但IL-10与其他mi RNAs之间无显著相关关系。多元逐步回归方程为IL-10=0.001-0.001×mi R-27a-3p（根据m RNA水平）;IL-10=1.508-0.999×mi R-27a-3p（根据蛋白水平）。（3）激光共聚焦显微镜下观察转染B细胞,荧光主要分布在细胞质中。流式检测显示B细胞的mi RNA转染率可达到（12.42%±0.94%）。（4）转染KD患儿纯化B细胞24h后,Antagomir-27a组B细胞IL-10表达显著高于NC组（P<0.05）。（5）转染正常儿童B细胞24h后,流式及ELISA检测Agomir-27a组和Antagomir-27a组B细胞胞内及培养上清IL-10表达水平,均较各自NC组明显降低或升高（P<0.05）。（6）与Agomir-27a-B10细胞组共培养的CD14+单核细胞TNF-α表达明显高于与Antagomir-27a-B10细胞组共培养的单核细胞（P<0.05）。（7）正常健康儿童外周血单核细胞与KD组或Ctrl组Antagomir-27a-B10细胞共培养,二者混合培养上清IL-10浓度均较各自NC组显著升高,而单核细胞TNF-α表达均下降（P<0.05）。（8）KD急性期CD14+单核细胞IL-10表达水平高于Ctrl组;KD单核细胞mi R-27a-3p m RNA表达水平在急性期也明显高于Ctrl组,IVIG治疗后表达下降。结论:KD急性期B细胞mi R-27a-3p表达上调,可通过抑制B10细胞的负调节功能促进单核细胞介导的炎症反应,参与KD发病。