牛肉、猪肉及牛粪中大肠杆菌O157的分离鉴定及其HEp-2细胞粘附基因的发现

来源 :中国人民解放军军需大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:zane11th
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在1996年9月到11月期间,从长春市数个自由市场分别采集牛肉和猪肉样品40和30份。在1997年5月到8月期间,从长春市两个农场和两个屠宰场采集牛粪样品176份。采用改良的大豆蛋白冻肉汤(mTSB)进行增菌、用山梨醇一麦康凯琼脂培养基(SMAC)作为鉴别培养基等分离培养法,经聚合酶链式反应及血清凝集试验等从2份牛肉(5%)、1份猪肉(3.3%)和3份牛粪(1.7%)样品中检出产志贺毒素大肠杆菌O157,除一株从猪肉分离的菌株96009的血清型为O157:NM(nonmobile)外,其余各分离株均为O157∶H7,另外还从一份牛粪样品中分离出一株产志贺毒素大肠杆菌08。上述所分离的所有菌株均为stx(志贺毒素基因)和eae(大肠杆菌粘附和微绒毛脱落基因)阳性,除猪肉分离株96009只产生志贺毒素(Shiga toxin,Stx)2外,其余各分离株菌同时Stx1和Stx2,从这些菌株中检出噬菌体型4、8和47,两个从牛肉分离的菌株及以往从我国山东省病人分离的一株产志贺毒素大肠杆菌O157∶H7菌株的噬菌体型均为4,而且具有相似的脉冲场凝胶电泳图谱。本试验在国内首次建立了从食品和动物中分离鉴定大肠杆菌O157的方法和程序,首次从食品和动物分离出大肠杆菌O157,首次对分离自不同样品的大肠杆菌O157的生物学性状进行了全面鉴定。以上结果表明在我国长春地区牛是大肠杆菌O157的带菌动物,该地区的牛肉和猪肉受到了大肠杆菌O157的污染,人有受到其感染的危险。 将产志贺毒素大肠杆菌O157∶H7菌株97094培养于含有不同浓度的萘啶酮酸(NA)的MacConkey琼脂平板上,获得对萘啶酮酸有抗性的菌株。用含有自杀性质粒pRT733的供体菌SM10λpir和抗萘啶酮酸的97094菌株做接合试验,使转座子TnphoA转入受体菌97094,那些插入到信号序列下游的变异体具有Km~r,NA~r表型,并在含有Km、NA、和XP的LB琼质平板上形成兰色菌落。对503个Km~r、NA~r的兰色菌落,测定了它们对HEp-2细胞的粘附性,其中有6株失去了对该细胞的粘附作用,用BamnL限制性内切酶对这些菌株的全细胞DNA进行酶切,用T4DNA连接酶将其连接于用相同的酶处理的质粒载体PBR322中,转化至受体菌DH5a,挑选那些具有Aa”、Km”的克隆,根据TnPhOA融合接点处的PhoA的洲A序列设计合成引物,对各克隆中h加M上游的大肠杆菌 O157:H7的DNA片段部分进行测序,测序结果做BLAST搜索,发现有4个变异体的TnPhOA插入到己知的与大肠杆菌O157粘附作用有关的紧密素基因eae中,有2个变异体的TnPhoA分别插入到eae之外的核昔酸序列中,其中变异体 44-l的 TnPhOA插入到大肠杆菌 O157:H7的一个功能未知的菌毛分于伴侣基因ycbR中,变异体47l的TnPhOA插入到了大肠杆菌O157:H7的一个功能未知的24182基因的起始密码和一10序列之间。这项研究表明,除紧密素等己知粘附因子外,大肠杆菌 O157:H7尚有其它因子参与对真核细胞的粘附,这些新因子的确切粘附作用还有待进一步阐明。
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