“跨界基因沉默”是一种利用大肠杆菌E.coliBL21（DE3）在哺乳动物细胞中传递siRNA并引起相应基因沉默的技术方法。在这种基因沉默系统中,人工设计的shRNA被克隆到跨界基因沉默质粒载体中,由载体上的T7启动子控制shRNA转录,经E.coliBL21（DE3）传递至靶标细胞中;细菌首先被哺乳动物细胞所吞噬,并逃逸到细胞质中,随后在细胞质中被裂解,释放出有沉默效应的shRNA;通过经典的Dicer/RISC途径,由siRNA介导的RNA干扰随即被触发。跨界基因沉默技术通过细菌载体传递特定的siRNA具有如下优势:首先,跨界基因沉默技术提供了一种非常实用的生物治疗方式;其次,与传统的siRNA传递技术相比,转染跨界基因沉默载体的细菌能持续产生shRNA,并保持shRNA的稳定;第三,耗费低廉,可节约操作成本。本课题对跨界基因沉默技术做了如下改良:1、利用跨界基因沉默质粒携带长双链RNA干扰序列干扰靶细胞中的目的基因。我们针对内源基因CTNNB1（cateninbeta1）和TUBA1B（tubulin alpha 1b）设计了干扰这两个基因的长双链序列,并将它们克隆到 dstrip 质粒（dsRNA trans-kingdom RNAi plasmid）上,使之表达相应的长双链RNA,用这两个质粒通过跨界基因沉默技术对SW480细胞进行处理,经qPCR和western blot检测,我们发现,靶基因的转录水平和蛋白的表达水平都受到了抑制,这表明长双链RNA可通过跨界基因沉默技术的传递对靶标细胞的目的基因进行RNA干扰。我们利用拼接PCR将这两个干扰片段连接成嵌合型双链,并将其克隆到dstrip上构建成dstrip C-T质粒（C代表CTNNB1,T代表TUBA1B）,用该质粒通过跨界基因沉默技术对SW480细胞进行处理,经qPCR和western blot检测,我们发现,这两个靶基因的转录和表达都受到了一定程度的抑制,这表明嵌合型长双链RNA也可以通过跨界基因沉默技术的传递对靶标细胞的多个目的基因进行RNA干扰。2、利用分子生物学方法构建了跨界基因沉默整合型质粒,它能快速的将跨界基因沉默质粒的工作元件整合到BL21（DE3）的染色体上,形成跨界基因沉默菌株。在本研究中,我们通过实验摸索出跨界基因沉默菌株的侵染条件,并证明跨界基因沉默菌株可以对靶标基因产生干扰作用。3、建立了能稳定表达nef蛋白的SW480-nef稳定细胞系和能稳定表达gag蛋白的SW480-gag稳定细胞系,针对HIV复制关键基因nef和gag设计了干扰这两个基因的长双链干扰序列,构建了dstrip-gag,dstrip-nef和dstrip-nef-gag质粒,用这三个质粒通过跨界基因沉默技术对含有各自靶标的稳定细胞系进行处理,我们发现,靶基因蛋白的表达水平得到了一定程度的抑制。同时我们利用跨界基因沉默整合技术构建了 BL21（DE3）-dstrip-nef,BL21（DE3）-dstrip-gag 和BL21（DE3）-dstrip-nef-gag干扰菌株,并通过实验证明这三株跨界基因沉默菌株能有效的抑制各自靶基因的蛋白表达。在细胞模型中,我们利用跨界基因沉默技术成功干扰了 HIV复制的关键基因,这初步证明利用跨界基因沉默技术来治疗艾滋病的策略是可行的。本文首次提出嵌合型双链RNA跨界基因干扰,验证了其可行性,并初步探讨了将这种技术用于艾滋病毒感染治疗。