论文部分内容阅读
来自石油污染土壤的铜绿假单胞菌株 SJTD-1可利用长链烷烃作为唯一碳源生长。我们已经测定并详细分析了假单胞菌株SJTD-1全基因组序列，证实铜绿假单胞菌株SJTD-1具有若干个烷烃降解酶的编码基因，推测与烷烃降解有关。然而假单胞菌株SJTD-1如何利用长链烷烃作为唯一碳源生存，编码烷烃降解酶的基因的表达调控机制是如何运行的我们一无所知。因此，本课题利用蛋白组相对定量技术分析SJTD-1的烷烃诱导差异蛋白组，从中鉴定与烷烃降解有关的蛋白，阐明烷烃降解机制。 为了建立蛋白组相对定量技术平台，本课题组建立了SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS两种蛋白组学定性技术，为研究铜绿假单胞菌SJTD-1差异蛋白组学的研究提供技术支撑。利用这两种技术平台分别鉴定获得1453和1623个可信蛋白；两种技术共鉴定到1912个可信蛋白。比较两种技术路线所鉴定到的蛋白种类差异，结果表明offline-2DLC-MS有利于SJTD-1菌株的膜蛋白、相对分子质量较大的蛋白和pI值不大于8的蛋白的鉴定；SDS-PAGE-1DLC-MS有利于pI值≥8，相对分子量较小的蛋白鉴定。另外对所有鉴定到的可信蛋白进行了 GO功能注释，亚细胞定位分析和代谢通路富集分析。总之，通过以上两种鉴定方法，我们获得铜绿假单胞SJTD-1菌株全蛋白组，为进一步分析 SJTD-1与石油分解相关的关键代谢通路和相关蛋白提供了重要的线索和技术支撑。 我们利用构建好的SDS-PAGE-1DLC-MS和offline-2DLC-MS两种技术平台建立了iTRAQ和lable-free相对定量技术研究假单胞菌烷烃诱导的差异蛋白组。通过两次iTRAQ相对定量蛋白组学重复实验，我们共到鉴定1871个可信蛋白，10996个唯一肽段。利用Mann Whitney Test检验两组数据的重复性，最终我们获得了476差异蛋白。其中267个差异蛋白在正十八烷烃（C18）生长条件下表达量提高，209个蛋白在C18条件下表达降低。另外，我们应用非标记相对定量蛋白组学技术研究在烷烃诱导条件下假单胞菌差异蛋白组，我们共鉴定到1966个蛋白，24514个唯一肽段；差异蛋白为571个，其中C18条件下生长表达量提高的蛋白有325个，C18条件下表达降低的下调蛋白是246个蛋白。因此iTRAQ和lable-free两种相对定量技术总共鉴定到可信蛋白2287个，占铜绿假单胞菌株SJTD-1基因组可预测编码的5618个蛋白的40.70％。两种技术总共鉴定到的差异蛋白为815个，其中上调464，下调351。 对这些差异蛋白进行了GO功能分类和KEGG代谢通路分析，发现AlkB2（SJTD-1_3623编码）和另一个与AlmA-like黄素单加氧酶有一定同源性的蛋白（SJTD-1_3636编码）的表达量明显上调，说明AlkB2和AlmA-like黄素单加氧酶的表达受C18强烈诱导。另外还发现alkB1和FAD依赖的单加氧酶表达上调。这是首次发现假单胞菌的四种单加氧酶受长链烷烃诱导，为研究长链烷烃代谢机制提供了重要的数据依据。GntR调控蛋白有可能是 alkB2的调控蛋白，组学实验显示 GntR调控蛋白表达上调，这是首次在蛋白组水平上证实 GntR调控蛋白和AlkB2同时受烷烃诱导过量表达，为单加氧酶调控机制的研究提供重要的基础和线索。此外，差异蛋白涵盖假单胞菌物质摄取和烷烃代谢的完整过程，特别的，在表达上调蛋白中发现了与趋化性、VI型分泌系统、环境压力和调控等相关的一系列蛋白，提示当烷烃存在时菌体这些生理活动增强，为探索烷烃降解机制、改造工程菌株提供了新的研究视角。 综上所述，本论文对石油高效降解菌SJTD-1受烷烃诱导的差异蛋白组进行了深入且详尽的研究，并对菌株的降解关键基因和调控分子机制进行了详细阐述，为其他烷烃降解菌株的机制研究与分子改造奠定了基础，必将推进相关机制研究与实际应用的进程。