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研究目的研究麦冬皂苷B(Ophiopogonin B,OP-B)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株A549和H460迁移侵袭及血管生成的抑制作用,及其在炎症微环境中抑制A549细胞迁移侵袭的分子机制,以期为揭示OP-B抗NSCLC的分子靶向机制提供研究基础,从而对OP-B抗NSCLC的作用提供新的认识。研究方法第一部分:体外通过Transwell实验、划痕实验及Western blot技术验证OP-B对A549细胞迁移侵袭及EMT通路的影响;体内通过裸鼠尾静脉注射A549细胞造成肺癌转移模型,结合肿瘤组织切片及HE染色观察OP-B对A549细胞的体内迁移抑制作用。体外通过血管环形成实验观察OP-B对血管内皮细胞EA.hy926血管生成的影响,结合Western blot技术检测OP-B对A549细胞中血管相关蛋白表达的影响;体内通过基质胶包埋实验检测OP-B对A549细胞移植瘤的血管生成和血红蛋白含量的影响。第二部分:在LPS诱导的THP-1与A549细胞共培养模拟的炎症模型下,通过Transwell实验和Western blot技术检测OP-B对A549细胞迁移侵袭的影响;qRT-PCR技术检测炎症模型下OP-B对A549细胞中linc00668的表达水平的影响;生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测linc00668所吸附的miRNA及其结合位点,qRT-PCR技术检测A549细胞中OP-B对miR-432-5p表达水平的影响及过表达miR-432-5p后E-cadherin、N-cadherin和Vimenten的表达情况;Western blot技术检测A549细胞转染linc00668或过表达miR-432-5p质粒后EMT通路相关蛋白的表达。研究结果第一部分结果:在NSCLC细胞株中转录组学和数字基因表达谱(DGE)筛选结果显示,在A549细胞中OP-B显著调节EMT通路。进一步的研究结果表明,A549细胞中10μmol/LOP-B下调EphA2和其磷酸化(Ser897)的表达,而在H460细胞中却使其上调。同时,Ras/ERK通路在A549细胞中不受影响,在H460细胞中被激活。更重要的是,EMT通路检测结果显示,OP-B给药促进了上皮标志物ZO-1和E-cadherin的表达,降低了间充质标志物N-cadherin和转录因子Snail、Slug和ZEB1的表达。此外,Transwell和划痕实验表明,10 μmol/LOP-B显著降低A549细胞的侵袭和迁移能力,同时体内研究发现,75 mg/kg OP-B在肺癌转移的裸鼠模型中抑制A549细胞转移。我们还发现在EA.hy926细胞中10 μmol/L OP-B显著抑制血管环形成。OP-B对该细胞系中VEGFR2、Tie-2和EphA2的表达、Akt(Ser473)、PLC(Ser1248)和EphA2(Ser897)的磷酸化均有抑制作用。在体内,通过基质胶包埋实验,我们发现OP-B抑制了 A549细胞移植瘤的血管生成和血红蛋白含量。第二部分结果:NSCLC细胞系的数字基因表达(DGE)分析表明,OP-B显著下调了linc00668的表达。我们通过将A549细胞与经LPS处理的THP-1细胞共培养模拟炎症微环境,发现模拟组的linc00668水平显著升高,而OP-B处理抑制了linc00668水平,并逆转了linc00668诱导的EMT。此外,linc00668在A549细胞中的过表达抑制了E-cadherin的表达,诱导了N-cadherin的表达,而OP-B处理逆转了这些变化。生物信息学预测和双荧光素酶报告基因检测证实,linc00668吸附miR-432-5p最终作用于EMT,在炎症微环境下,发挥A549细胞的抗迁移功能。结论1.OP-B通过抑制EphA2/Akt及其通路,抑制肺腺癌A549细胞体内外的转移和血管生成;2.在炎症微环境下OP-B通过linc00668/miR-432-5p/EMT轴抑制A549细胞的转移。