阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以认知功能障碍为主要表现的神经退行性疾病，由于其发病机理复杂，加之脑内所形成的病理改变逆转十分困难，因此，给临床治疗和防治AD药物的研究与开发带来了极大的困难，至今尚无理想的治疗药物问世。由于AD属于多基因复杂性疾病，多种基因及其表达产物在其中枢认知功能障碍发生的病理生理过程中具有重要调控作用。因此，研究、阐明这些重要调控基因的功能对于揭示AD的发病机理以及防治AD药物靶标的发现和研究均具有重要意义。囊泡谷氨酸转运体（Vesicular glutamate transporter,VGLUT）是神经元囊泡谷氨酸递质的转运体，目前有3种类型被鉴定。其中VGLUT1主要在神经元富集区如大脑皮层和海马中表达，并选择性地位于兴奋性谷氨酸能神经元突起末端的突触囊泡上，担负着将囊泡外谷氨酸运输进突触囊泡内，并在突触中调节这种兴奋性神经递质释放以及在后续生理过程中的重要功能，是谷氨酸能神经元及其轴突末端高度特异的标志物。VGLUT1表达水平的变化对于谷氨酸突触传递的效能具有重要影响，其表达水平则反应了谷氨酸能神经元及其突触的数目、活动度以及功能状态。但VGLUT1的表达与学习记忆功能的关系尚不十分清楚。本室在前期研究中发现，给予12月龄快速老化模型小鼠SAMP8连续口服石杉碱甲和六味地黄汤4周，其海马VGLUT1的表达发生了明显改变，提示AD治疗药物石杉碱甲和具有益智作用的中药复方六味地黄汤对学习记忆功能的影响与调节海马VGLUT1的表达具有一定关系。快速老化模型小鼠（senescence-accelerated mouse，SAM）的快速老化亚系SAM-prone/8，SAMP8)的典型特征是随增龄呈现学习记忆功能障碍，脑内出现神经元丢失、Aβ沉积等类似AD的病理改变及多种基因的表达异常，是在基因和蛋白水平研究AD的良好模型。为揭示VGLUT1与学习记忆功能的相关性，探索其做为防治AD药物筛选靶标的可能性，并为后续研究积累实验依据，本研究以SAMP8为模型，采用实时定量PCR和Western-blot以及免疫组化技术，首先观察了SAMP8增龄过程中海马和皮层VGLUT1表达和分布变化，以探讨其在学习记忆功衰退过程中表达变化的规律；进而采用穿梭箱实验，观察了VGLUT1的表达与小鼠在条件性回避反应实验过程中与学习记忆获得的关系；在此基础上，观察了对AD病人或模型动物具有良好疗效、但功能主治不同的中药复方六味地黄汤（LW）、八味地黄汤（BW）、黄连解毒汤（HL）、调心方（TXF）和当归芍药散（DSS），以及目前临床用于AD治疗的药物石杉碱甲，对VGLUT1基因和蛋白表达的影响，以探讨其对防治AD药物的反应性。一、快速老化模型小鼠增龄过程中海马及皮层VGLUT1表达和分布的变化SAMP8的典型特征是认知功能呈增龄性衰退，为了揭示VGLUT1是否与增龄性认知功能衰退相关，本研究采用实时定量PCR和Western-blot以及免疫组化技术，观察了SAMP8在增龄过程中海马和皮层VGLUT1基因和蛋白的表达变化及分布。1．APP表达APP是AD病人脑内老年斑主要组成成分Aβ的前体蛋白，已有大量研究表明，APP转基因小鼠表现有明显学习记忆功能障碍，此外，SAMP8在增龄过程中其脑内APP基因和蛋白表达以及β淀粉样沉积逐渐增多。因此，本研究以APP表达为对照，首先观察了SAMP8在增龄过程海马和皮层APP基因和蛋白表达的变化。结果表明，SAMR1海马和皮层中APP基因和蛋白的表达随增龄无明显改变，而SAMP8海马和皮层APP基因和蛋白表达则随增龄逐渐升高；与同月龄SAMR1相比，APP基因和蛋白在2月龄SAMP8海马和皮层中的表达无变化，但在6和12月龄其表达均明显高于同龄SAMR1对照组。2．VGLUT1表达和分布的变化本研究结果表明，随着月龄的增加，SAMR1海马和皮层VGLUT1的基因和蛋白表达无明显改变。而SAMP8海马和皮层VGLUT1的表达则呈现出与SAMR1不同的变化规律，表现为先降低后升高，呈现“V”字曲线。即在2月龄时其表达与同龄SAMR1相比无明显改变，6月龄时表达明显低于2月龄及同龄SAMR1，12月龄时表达则恢复至接近2月龄水平，且与同龄SAMR1相比无明显差异。免疫组化观察结果表明，VGLUT1主要存在于皮层、海马神经元的胞质与胞膜中，尤其是海马齿状回中分布较多。VGLUT1基因和蛋白在SAMR1和SAMP8海马和皮层中的增龄性表达变化规律是相同的，即SAMR1海马和皮层VGLUT1中分布随增龄无明显改变；SAMP8在2月龄时其表达与同龄SAMR1相比无明显改变，6月龄时表达明显低于2月龄及同龄SAMR1，12月龄时表达则恢复至接近2月龄水平，与同龄SAMR1相比亦无明显差异。二、VGLUT1表达与小鼠学习记忆获得的关系为进一步研究VGLUT1表达与学习记忆功能的关系，本研究应用反映动物条件性回避反应学习记忆行为能力的穿梭箱实验，观察了VGLUT1表达与小鼠学习记忆获得的关系。实验选用雄性小鼠，连续实验6天。于实验第6天结束后根据学习成绩优劣分成6组，并以未进行学习行为实验小鼠为对照。然后观察了其海马和皮层APP和VGLUT1基因和蛋白的表达的改变，以探讨VGLUT1表达与学习记忆获得的关系。实验结果表明，与对照组相比，海马和皮层VGLUT1基因和蛋白表达量均与学习记忆成绩呈明显正相关关系，提示VGLUT1可能参与了学习记忆的生理过程。三、益智中药复方和石杉碱甲对SAMP8海马和皮层VGLUT1表达的影响已有临床研究结果表明，当归芍药散、调心方、黄连解毒汤等中药复方对AD病人具有良好的治疗效果；大量实验药理学研究结果表明，六味地黄汤、八味地黄汤等对多种原因所致动物学习记忆功能障碍具有明显改善作用，这些中药复方的功效是不同的。石杉碱甲为临床常用的AD治疗药物。为观察VGLUT1对上述药物的反应性，本研究选用12月龄SAMP8，分别灌胃给予六味地黄汤（10g/kg）、八味地黄汤（10.5 g/kg）、当归芍药散（3.4 g/kg）、调心方（34.7 g/kg）、黄连解毒汤（5 g/kg）和石杉碱甲(5×10^-6g/kg)，连续5周。采用实时定量PCR和Western-blot技术，观察了SAMP8海马及皮层APP和VGLUT1基因和蛋白的表达变化。结果表明，与同龄SAMR1相比，SAMP8给水模型组海马VGLUT1基因和蛋白表达均明显升高，皮层VGLUT1表达水平与SAMR1对照组无明显差异；SAMP8海马和皮层APP表达则均较SAMR1对照组明显升高。给予中药复方和石杉碱甲处理后，SAMP8海马和皮层VGLUT1基因和蛋白表达均降低，其中除黄连解毒汤组外，其它各给药组与SAMP8对照组相比均具有统计学差异。药物处理组SAMP8海马和皮层APP基因和蛋白表达的结果与VGLUT1相似，给药后均下降，在海马中除当归芍药散外，其它给药组与对照组相比均具有统计学差异。以上结果表明，海马和皮层VGLUT1的表达随中枢学习记忆功能的衰退和学习记忆的获得而发生规律性变化，提示海马和皮层VGLUT1与中枢学习记忆功能具有密切关系，参与了中枢神经系统正常学习记忆功能的维持或调节过程。在本文的撰写过程中，我们发现今年4月Neurobiolgy of Aging上于网上刊出了一篇定稿文章，该文报道了AD病人前脑皮层VGLUT1表达明显降低，且与AD病人的认知功能低下的程度呈正相关。该研究结果支持本研究所作出的结论。此外，本研究发现，SAMP8给予益智药物后，其海马和皮层VGLUT1表达明显下调，提示其对益智药物治疗具有良好的反应性，通过调节VGLUT1的表达可能是上述益智药物发挥益智作用的途径之一。因此，有理由认为，VGLUT1具有成为防治AD药物筛选靶标的潜在价值，值得进一步深入研究。大量研究结果表明，SAMP8在2月龄时已开始出现学习记忆功能的损害，随后呈进行性加重，6月龄时已十分明显，12月龄时更为严重。本研究结果表明，SAMP8在增龄过程中海马和皮层VGLUT1的表达变化曲线呈“V”字型，即在2月龄时与同龄SAMR1无明显差异，6月龄时表达明显下调，随后又升高，12月龄时达到2月龄水平，与同龄SAMR1相比亦无明显差异。针对这一现象，我们作了初步分析。我室以往研究表明，SAMP8在2月龄时其海马和皮层谷氨酸含量均明显高于同龄SAMR1，随增龄呈下降趋势，但仍高于同龄SAMR1。已知VGLUT1的主要功能是将谷氨酸能神经元突起中囊泡外的谷氨酸运输进突触囊泡内，是调节谷氨酸释放的重要因素。谷氨酸是参与中枢学习记忆生理过程中的重要神经递质之一，但高浓度谷氨酸则对神经元具有毒性作用。因此，谷氨酸递质释放调控系统的功能正常，是维持中枢神经系统正常学习记忆功能和防止谷氨酸过多而造成神经元损害的重要条件。基于以上研究结果和分析，我们认为，由于SAMP8在2月龄时海马和皮层的谷氨酸含量已明显高于同龄SAMR1，因此在2～6月龄时其海马和皮层VGLUT1表达量的下调是一种代偿性反应，其生理意义可能是通过下调VGLUT1的表达而降低海马和皮层过多的谷氨酸，以维持正常学习记忆功能和防止神经元受损。但随着增龄和脑老化不断加重，VGLUT1调节机能障碍，通过降低VGLUT1表达来降低海马和皮层过量谷氨酸的调节机制发生失代偿，表现为VGLUT1的表达量在12月龄时回升。此外，12月龄SAMP8给予益智药物后VGLUT1表达下调，其机理可能是给药后VGLUT1调节功能得到改善，通过VGLUT1的代偿机制在一定程度得到恢复的缘故。然而，我们对于海马和皮层VGLUT1与中枢学习记忆功能关系的研究还在初步阶段，有待进一步深入研究。