自从世界上第一例体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)婴儿诞生以来,人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)已经走过了37年的发展历程。随着人们对配子与胚胎培养条件的不断优化,辅助生殖技术的成功率显著提高,现已成为治疗不孕不育症的理想治疗措施之一。近年来,一系列辅助生殖相关技术,如卵子体外成熟(in vitro oocyte maturation,IVM)、移植前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)、单胚胎移植(single embryo transfer,SET)以及玻璃化冷冻技术等获得了极大的发展,为降低常规IVF-ET的费用、风险等提供了可能。我们的目标是安全、有效、舒适ART。而男性不育症的两项巨大突破是卵胞浆内单精子显微注射(introcytoplasmic sperm injection,ICSI)的发明和无精子症患者睾丸或附睾精子的ICSI应用。受精(Fertilization)过程是生命发生的开端,是人类生殖过程的重要环节。受精过程的一些步骤和环节仍有不十分明了,因此在目前无法准确预测完全受精失败和低受精率的情况下,如何提高受精率和可用胚率仍是研究的方向。一方面,ICSI技术本身的潜在风险,在指证的选择上应该倾向于保守和严谨;另一方面,IVF会出现不受精情况。因此,临床医生在选择辅助生殖方案时,要仔细询问病史,斟酌治疗方案,让患者在第一个治疗周期中尽量减少风险。对于精液质量较低或多年原发不孕的患者,为了避免所有卵母细胞完全不受精,将卵母细胞受精时分为两部分:一部分进行常规IVF,另一部分行ICSI,即分半IVF/ICSI(Half-ICSI)。在临床工作中,如果发生受精失败或受精率低下,应积极采取补救方法,一般采用IVF短时受精。即在获卵后2–2.5小时与PESA精子短时受精,精卵共孵育4–5小时后剥除颗粒细胞,通过观察卵母细胞是否排出第二极体来推测其受精与否,对可能发生受精失败的患者立即补救ICSI(rescue-ICSI,Re-ICSI)。IVF短时受精,需要观察第二极体(polar body,Pb)判断受精情况。明显的2Pb和1Pb容易观察区分,但是部分患者存在碎Pb,影响第二极体的判断。第二极体的判断主要受实验室胚胎技术人员的经验等的影响,碎Pb在短时受精病例中的处理方式尚存在疑惑。梗阻性无精子症(obstructive azoospermia,OA)是指从生精小管到射精管任何一处发生阻塞但生精功能正常造成的无精子症。对于OA,标准的治疗方法是经皮附睾穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)和ICSI。有报道PESA精子经常规IVF或人工受精(intrauterine insemination,IUI)能受孕并有健康婴儿出生,这表明附睾精子在体内和体外均具有受精能力。精子低渗肿胀实验(hypoosmotic swelling test,HOS)实验和IVF受精率及受精失败的关系尚不明确。有学者认为HOS实验评分不能预测IVF受精情况。也有学者将HOS实验根据精子尾部肿胀类型分为4个亚型HOS1-4,认为HOS亚型对精液正常的不明原因不孕患者能提示其生育能力。自发的精子尾部肿胀(spontaneously developed tail swelling,SDTS)可能是引起HOS实验结果差异的原因之一。IVF受精用的精液是密度梯度处理后的精液,这时的精液参数与受精的关系密切,是我们研究的重点。与新鲜胚胎移植周期相比,冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)周期具有更好的内膜容受性以及胚胎与内膜发育的同步性,且可以避免卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)。选择全胚冷冻后择期冻胚移植的患者,所采用的自然周期或雌孕激素替代周期更加接近自然状态的种植方式,具有良好的内膜容受性以及内膜与胚胎发育的同步性,所以可获得明显高于前者的妊娠率和种植率。随着冷冻技术的改善,玻璃化冷冻技术减少了冷冻对胚胎的伤害,复苏后胚胎的存活率可达95-100%。在此前提下,凡是不适合新鲜周期移植的情况都可以进行全胚冷冻然后复苏移植。因此,本课题拟从5个方面开展研究:⑴经皮附睾精子抽吸术和短时受精用于治疗梗阻性无精子症;⑵严重少、弱精子症患者行分半短时IVF/ICSI受精方式的研究;⑶碎极体对短时受精补救ICSI影响的研究;⑷精子低渗肿胀试验在短时受精完全受精失败中的作用;⑸IVF获卵数、全胚冷冻与体外受精胚胎移植妊娠结局的关系。第一部分经皮附睾精子抽吸术和短时受精用于治疗梗阻性无精子症目的:对于梗阻性无精子症患者,标准的治疗方法是经皮附睾穿刺取精和卵胞浆内单精子显微注射。PESA和常规IVF受精率低,研究OA患者PESA取精能获得足够数量活动精子的采用短时受精和Re-ICSI方法的效果。方法:选取女方获卵数多于10个,男方PESA获得足够数量优质精子的患者纳入研究。将同源卵子随机分为两组,一半卵子在获卵5小时后用市售透明质酸酶剥除颗粒细胞行ICSI。另一半卵子在获卵后2–2.5小时与PESA精子短时受精,精卵共孵育4–5小时后剥除颗粒细胞,观察第二极体,再决定是否行Re-ICSI。比较ICSI和Re-ICSI两组比较两组成熟卵子率、受精率、1PN受精率、2PN受精率、>2PN受精率、2PN卵裂率、晚卵裂率、优质胚胎数和优质胚胎率。结果:OA患者平均年龄为25.6±5.3岁,女方患者年龄在22到32岁之间,平均不孕年限4.1±4.7年。共有20对夫妇,282个卵母细胞纳入研究,每组141个卵母细胞。PESA短时受精组在受精4小时后颗粒细胞容易剥除,观察没有发现第二极体,行Re-ICSI。因此短时受精组也是Re-ICSI组。比较ICSI和Re-ICSI两组比较两组成熟卵子率、受精率、1PN受精率、2PN受精率、>2PN受精率、2PN卵裂率及晚卵裂率均相似,差异没有统计学意义。Re-ICSI组优质胚胎数和优质胚胎率与ICSI组比较,没有统计学意义。结论:本研究对梗阻性无精子症患者PESA取出的精子采用短时受精Re-ICSI的方法,首次发现未经离心的PESA精子能消化颗粒细胞,但没有受精能力,因此可以替代合成的透明质酸酶使用。将PESA精子用于IVF短时受精Re-ICSI和PESA精子直接行ICSI两组比较,结果相似。认为使用PESA得到的精子和短时受精加上Re-ICSI是治疗男性梗阻性无精子症的可行性方法。然PESA精子短时受精和Re-ICSI过程比PESA-ICSI稍复杂,但是治疗OA的一种有效方式。第二部分严重少、弱精子症患者行分半短时IVF/ICSI受精方式的研究目的:严重少、弱精患者一般直接行ICSI技术,然而此类患者IVF有受精的可能,探讨对此类患者的卵母细胞一半行短时IVF受精,早补救ICSI,一半直接行ICSI受精方式。方法:回顾性分析在本中心接受辅助生殖治疗50个周期的精液参数为严重少、弱精的患者。取卵日男方精液为密度:1~5×106/ml,前向运动(PR)精子10~50%,畸形精子率<95%的获卵数≥10个患者。受精方式分半IVF/ICSI,其中IVF采用短时受精。即对1/2的卵行IVF短时受精,及时补救ICSI;1/2行ICSI助孕。结果:有41例病人数小时内可留取第二次精液,第二次精液液化时间短,精液量少,密度稍低,但PR精子百分率高,有统计学意义;50周期中17周期IVF受精:比较同源卵子行IVF和ICSI受精率、卵裂率、可用胚胎数及优胚数,IVF受精率低于ICSI,差异有显著性,但可用胚胎数和优胚数两组无差异;50周期中33周期IVF受精失败,其中31周期6小时后去除颗粒细胞观察Pb,所有的减数第二次分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)卵均未见2个Pb者,及时行Re-ICSI。另2例虽部分卵子可见2个Pb,但IVF均未受精;31例Re-ICSI周期中同源卵子ICSI与Re-ICSI比较,受精率,卵裂率,可用胚胎数两组无差异,优胚率Re-ICSI稍高,差异无显著性。结论:严重少、弱精症患者采用分半短时IVF/ICSI受精方式,其中IVF采用短时受精。即对1/2的卵行IVF短时受精,及时补救ICSI;1/2行ICSI助孕。首次将Half-ICSI和IVF短时受精Re-ICSI相结合。男方精液必要时可留取第二次精液,第二次精液液化时间短,精液量少,密度稍低,但PR精子百分率高。处理后只要有足够的精子,IVF有受精的可能,短时受精Re-ICSI周期中同源卵子ICSI与Re-ICSI有相似的结局。对严重的少、弱精症患者如果IVF可受精则优先选取IVF受精来源的胚胎进行移植,是另一种可行的预防常规IVF受精失败的授精方式,此方法一定程度避免了ICSI来源胚胎的移植,也可获得满意的妊娠结局。第三部分碎极体对短时受精补救ICSI影响的研究目的:探讨碎极体在短时受精Re-ICSI中不同处理方式对受精情况的影响。方法:IVF短时受精后去除颗粒细胞观察第二极体。根据Pb情况分为三组,组①:即IVF完全受精失败周期,所有MⅡ卵均未见2Pb,1 Pb和碎Pb卵子均行Re-ICSI;组②:2Pb占MⅡ卵≥30%时,全部卵子不行Re-ICSI;组③:即受精率低下周期,2Pb占MⅡ卵<30%时,1Pb卵子行Re-ICSI,碎Pb卵子不行Re-ICSI。结果:177个短时受精周期,碎Pb卵子共197枚,占MⅡ卵比例12.1%(197/1632)。组①41周期,其中1 Pb卵子328枚、碎Pb卵子49枚,无2Pb卵子;组②103周期,期中1 Pb卵子173枚、碎Pb卵子112枚,2Pb卵子668枚;组③33周期,期中1 Pb卵子203枚、碎Pb卵子36枚和2Pb卵子63枚。组①中碎Pb和1Pb行Re-ICSI 2PN受精率分别为81.6%和82.0%,差异无统计学意义(P>0.05);组①中碎Pb和1Pb行Re-ICSI多PN受精率分别为6.1%和3.9%,差异无统计学意义(P>0.05);组②和组③中碎Pb IVF 2PN受精率分别为19.6%和16.7%,均低于2Pb IVF2PN受精率79.8%和71.4%,差异有统计学意义(P<0.05);组②和组③中碎Pb IVF多PN受精率分别为4.5%和5.5%,与2Pb IVF多PN受精率3.9%和3.2%相比,差异无统计学意义(P>0.05);组①中Re-ICSI 2PN受精率82.6%(309/374)和组③Re-ICSI 2PN受精率81.8%相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:IVF短时受精,需要观察第二极体判断受精情况。明显的2Pb和1Pb容易观察区分,但是部分患者存在碎Pb,影响第二极体的判断。碎Pb占MⅡ卵比例12.1%(197/1632)。因此,碎极体在短时受精Re-ICSI中正确处理对提高卵子利用率及妊娠结局有很大影响。本研究认为碎极体在不同受精情况下应区别对待:所有的MⅡ卵均未见2Pb患者碎Pb应和1Pb同样对待,均行Re-ICSI。部分MⅡ卵有Pb2患者碎Pb均不行Re-ICSI,这样IVF受精率虽然稍低,但避免出现重复受精的可能。这可能是我们多PN发生率并未增加的原因。第四部分精子低渗肿胀试验在短时受精完全受精失败中的作用目的:比较精子低渗肿胀实验亚型在短时受精完全受精失败组和正常受精组中的区别。方法:原发不孕获卵数多于7个的患者行短时受精,对所有成熟卵母细胞均未见第二极体的行Re-ICSI,18小时后观察可见正常2原核(pronucleus,PN)的为完全受精失败组(total fertilization failure,TFF),共有42对夫妇纳入研究。选取同期IVF短时受精正常,未行Re-ICSI的为对照组。HOS根据精子尾部肿胀部位分为4个亚型HOS 1,HOS 2,HOS3,和HOS 4,并排除SDTS,在精液密度梯度离心处理前和处理后分别计数HOS 4个亚型和SDTS。比较TFF组和受精正常组HOS差异。结果:TFF组和对照组患者女方年龄,男方年龄,不孕年限和基础窦卵泡数比较均无统计学差异(P>0.05);精液密度梯度离心处理前完全受精失败组和对照组患者HOS1~4比较,均无统计学差异(P>0.05);在除外SDTS后两组HOS1~4比较均无统计学差异(P>0.05)。精液密度梯度离心处理后完全受精失败组和对照组患者HOS1~4比较,均无统计学差异(P>0.05);除外SDTS后的两组HOS1,2,4比较,差异无统计学意义(P>0.05),HOS 3在受精正常组明显高于完全失败组,差异有统计学差异(P<0.05)。精液密度梯度处理在除外SDTS后HOS 3于20的患者应警惕IVF受精失败的可能。但有部分患者HOS 3与正常组相似,这部分患者完全受精失败的原因可能是卵子方面的原因。结论:对接受助孕治疗的夫妇对精液常规分析未见明显异常患者如何预防完全受精失败或低受精率成为改善这些患者IVF结局的重要环节。本实验将精子低渗肿胀实验根据精子尾部肿胀部位分为4个亚型HOS 1,HOS 2,HOS 3,HOS 4;排除了SDTS对HOS实验的影响;除了比较精液处理前的情况,对梯度离心后直接受精的精液也进行了研究。认为精液密度梯度处理在除外SDTS后HOS 3低的患者应警惕IVF受精失败的可能。但有部分患者HOS 3与正常组相似,这部分患者完全受精失败的原因可能是卵子方面的原因。第五部分IVF获卵数、胚胎玻璃化冷冻与体外受精胚胎移植妊娠结局的关系目的:探讨控制性超促排卵(COH)中获卵数对IVF-ET妊娠结局的影响,及为避免重度OHSS采用自制麦管载体全胚冷冻的效果。方法:接受常规IVF助孕治疗的不孕症患者358例(除外ICSI,Half-ICSI,Re-ICSI)。根据获卵数不同分为三组,其中获卵数1~10者122例(Ⅰ组),获卵数11~20者183例(Ⅱ组),获卵数>20者53例(Ⅲ组);358例中发生OHSS 48例全胚冷冻,其中Ⅰ组无全胚冷冻,Ⅱ组全胚冷冻28例,Ⅲ组全胚冷冻20例。胚胎冷冻采用自制麦管载体。结果:三组OHSS发生率比较:358例中新鲜移植组310例,发生OHSS全胚冷冻组48例。三组全胚冷冻率分别为0,15.3%和37.7%,差异有显著性;全胚冷冻组与新鲜移植组比较:年龄及优胚率无明显差异,着床率及临床妊娠率无明显差异;新鲜移植第Ⅲ组着床率及临床妊娠率低于全胚冷冻第Ⅲ组,差异有显著性。结论:随着获卵数增多,OHSS发生率增加,OHSS时全胚冷冻保证了妊娠结局,尤其对获卵数>20的重度OHSS患者有利,其着床率及临床妊娠率最高。可能与这部分患者卵巢反应好,可供选择的胚胎数量多,相对胚胎质量高,且FET周期更符合生理过程,行激光辅助孵化有关。我们采用自制冷冻载体取得专利,提供结构简单、易于操作、成本低廉、一次性使用等优点的一种生物材料玻璃化冷冻载体。这使得玻璃化冷冻解冻损伤降低,全胚成活率提高,为全胚冷冻提供了保障。