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本研究以中国对虾为材料，从病虾组织中分离出白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，简称WSSV）野生毒株（暂时命名为浙江株，WSSV-ZJ），以该病毒基因组为模板，采用PCR技术扩增了WSSV-ZJ的囊膜蛋白VP28和VP19的基因，分别采用大肠杆菌和杆状病毒-昆虫表达系统进行了这两个基因的表达研究，并初步试验了蚕蛹表达产物在螯虾抗对虾白斑综合征（WSS）的效果。主要研究结果如下： 1．2001年5月从浙江省象山县某对虾养殖塘采集患白斑病的中国对虾，用WSSV的实验模式动物克氏原螯虾（Cambarus proclarkii）作了动物回归试验，试验虾在3～10天内几乎全部死亡；用蔗糖密度梯度法纯化的病毒在电镜下的大小、形态特征与WSSV极为相似（完整的病毒粒子大小约100×400nm，核衣壳大小约60×350nm）；以该病毒基因组DNA为模板，应用PCR技术，扩增出了WSSV的特异性条带，从而从病毒的致病性、形态特征和特异性DNA片段等方面证实了分离获得的病毒是对虾白斑综合征病毒。 2．利用PCR技术，扩增获得了病毒的两个囊膜蛋白基因，基因序列全长分别为615bp和366bp，编码的氨基酸残基数分别为204和121，它们与GenBank中登录的WSSV囊膜蛋白VP28和VP19基因的同源性均在99％以上，而与其它病毒DNA片段的同源性则很低。 3．将克隆到的vp28、vp19基因通过适当的酶切后插入到表达载体pET30a的多克隆位点中，获得重组质粒pET30a-vp28和pET30a-vp19。将它们导入E.coli.BL21中，在37℃下，经IPTG诱导表达4小时后，用SDS-PAGE和Western blotting进行检测，发现vp28基因的表达产物均出现了明显的特异性条带，其融合表达产物的大小与预测的一致，而在vp19基因均未见表达产物的特异性条带。 4．为了获得与天然VP28、VP19结构与活性较一致的表达产物，本研究采用了表达产物后加工较完善的杆状病毒一家蚕表达系统。将克隆到的vp28、vp19基因通过适当的酶切后插入到转移质粒pBlueBacHisC的多克隆位点中，获得重组质粒pBlueBacHisC-vp28和pBlueBacHisC-vp19。将重组质粒分别与新型杂交病毒HyNPV（具有BmNPV和AcNPV双重优点）共转染Sf9细胞（秋粘虫细胞株），通过蓝白斑筛选分别获得了重组病毒HyNPV-vp28和HyNPV-vp19(滴度分别为：0.69×107.7和0.69×107.6)。将这两种重组病毒分别感染Sf9细胞，三天后细胞均发生了严重的病变；将它们分别穿刺接种家蚕五龄起蚕，3～4天后家蚕出现了明显的发病症状（蚕体体壁半透明，环节肿胀等）。接种后4-5天，取病蚕的血淋巴进行SDS-PAGE和Western blot检测，均出现了明显的特异性条带。融合表达产物的分子量比根据核苷酸序列预测的分别要大4KD左右，与天 浙江人学博士学位论文；中文摘要然的VP28、VP19分子量较一致，证明在该表达系统中表达产物得到了较完善的后加工。 5．将含重组WSSV囊膜蛋白的蚕蛹加入饵料，用克氏原螫虾（WSSV的实验模式动物）进行了抗 WSS的初步试验。以 0O、l0、50和 20O的比例在基础饵料中分别添加含重组蛋白VP28、VP19和VP28＋VP19的蚕蛹。结果显示：（l）在试验最初的 15天中，试验组平均死亡率为 18．5％，其中组 14（含20％VP28＋VP19的蚕蛹）死亡率高达50％，而作为对照的组1（不加蚕蛹）为3．3％，组2、3、4（加 1O、5O、20O无病毒感染蚕蛹）平均为 6．7O，组 5、6、7（加 1O。5o、20OH州PV病毒感染的蚕蛹）平均为7．8O，组14死亡率比三个对照组分别高 46．7O（PMO．of）、43．3O（PMO．of）和 42．2O（PMO．01），其它试验组与对照均无显著差异（P＞队05）；（2）在试验第16一3O天期间，试验组平均死亡率为3．5％，三个对照平均死亡率为3．3％，二者无明显差异（P＞O．05人 门）在试验的第 31、32天攻毒M天（饲喂含 WSSV的病虾肉），于第 34天开始发病，在第37—40天期间出现死亡高峰，在第45天试验结束时，试验组平均死亡率为7．7O，三个对照平均为97．lO，前者比后者低89．4O（PMO．of）。