论文部分内容阅读
支气管哮喘是全球范围内严重威胁公众健康的慢性疾病,气道炎症和气道重塑是其两个主要病理学特征。多数学者认为哮喘的气道重塑是对反复炎症损伤的反应,最终导致结构改变,即气道重塑是由炎症刺激物持续存在引起的。但气道重塑的分子机制及是否可以真正逆转尚不清楚,目前也缺乏用以评价气道重塑的指标和干预措施,气道重塑的机制及治疗已成为当前国内、外研究的重点。
气道的神经调节系统除了经典的肾上腺素能和胆碱能神经外,还存在一种非肾上腺素能非胆碱能(nonadrenergie noncholinergic,NANC)神经系统,感觉神经肽是其重要的神经递质。目前认为与哮喘关系较为密切的感觉神经肽有P物质(Substance P,SP)、神经激肽A(Neurokinin A,NKA)、神经激肽B(NeurokininB,NKB),通过相应的NK-1R、NK-2R、NK-3R等受体发挥作用。尚云晓等研究表明,感觉神经肽(NKA、NKB、SP)与小儿哮喘的发作及缓解关系极为密切,激素治疗有显著降低哮喘患儿血及支气管诱导痰液中上述感觉神经肽的作用,而且发现豚鼠哮喘模型急性期的支气管中NK-1R表达增多。但感觉神经肽受体在哮喘气道重塑各阶段的表达尚少见报道。
在受到伤害性刺激时,SP可逆向释放入损伤局部组织中,参与对修复细胞增殖、迁移、分化的调控,有研究表明,SP可促进成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等细胞的增殖、迁移。目前认为,平滑肌的变化是气道重塑的结构基础。有研究发现经过SP刺激后,气管平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC)DNA合成显著增加,表明SP可以促进ASMC的增殖,但在ASMC的迁移、合成分泌中SP及其受体的作用尚未见报道。
细胞骨架由微丝、微管及中等纤维组成,三者高度协调分布,与胞核、质膜、细胞器相连,构成了细胞形态骨架和运动协调系统,以此维持细胞的特定形状和细胞内多种成分的空间位置,近年来的研究进一步证实,细胞骨架网络系统还广泛参与细胞增殖、分泌、运动、粘连、信号传递、分化等与生命现象相关的活动过程,并且在许多疾病中有过表达现象。但是目前却鲜有从细胞骨架方面去研究哮喘气道重塑的发生机制的研究。
有研究表明,小G蛋白家族中RhoA/ROCK信号途径参与细胞内肌动蛋白细胞骨架结构和功能的调控,故受到广泛重视。近年来的研究发现RhoA/ROCK信号通路参与哮喘发病的众多病理生理过程,例如参与哮喘气道高反应性(Airwayhigh reactivity,AHR)的形成、嗜酸性粒细胞向气道趋化聚集、气道重塑等。然而RhoA/ROCK信号途径在哮喘气道重塑ASMC中微管骨架重构中的作用则少见报道。
目的:
本研究应用卵蛋白(Ovalbumin,OVA)对SD大鼠进行2w、4w、6w、8w不同时间的激发,建立哮喘气道重塑动物模型,并原代培养SD大鼠气管平滑肌细胞,探讨感觉神经肽受体在哮喘气道重塑中的表达、作用及细胞内信号传导机制,为寻求哮喘气道重塑的防治提供新思路。
材料与方法:
1、SD大鼠哮喘气道重塑模型的建立:体重60~80g幼年SD大鼠随机分组,按OVA激发时间的不同分为哮喘组(2w、4w、6w、8w)及同期对照组(2w、4w、6w、8w)和布地奈德组(8w)、孟鲁斯特组(8w),每组8只。哮喘组于第1天与第8天腹腔注射抗原致敏液1ml,从第15天开始,以1%OVA超声雾化吸入,每次30min,每周3次,持续时间分别为2w、4w、6w、8w。对照组应用生理盐水代替致敏液和OVA。布地奈德组:每次激发前30min,给予布地奈德混悬液2.5mg/Kg,加生理盐水至2ml,放入百瑞PRONEB压缩吸入机驱动雾化吸入,共8w。孟鲁斯特组:每次激发前2h,给予孟鲁斯特15mg/kg灌胃,共8w。
2、标本采集与保存:每组大鼠于末次激发24h内腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,进行左肺肺泡灌洗。右肺中叶置于4%多聚甲醛用于HE染色和免疫组化染色。剩余气管及肺组织-80℃冰箱保存用于抽提总RNA、抽提蛋白及羟脯氨酸测定。
3、支气管病理学观察:HE染色,图像分析测定支气管基底膜周径(Pbm)、总管壁面积(Wat)及平滑肌面积(Wam)。
4、大鼠气管平滑肌细胞(ASMC)的原代培养:用酶消化法原代培养,差速贴壁法纯化细胞,第3~5代的ASMC用于实验。
5、四甲基偶氮唑蓝显色法(MTT):检测ASMC增殖。
6、transwell小室:检测ASMC迁移。
7、免疫化学染色:检测支气管NK-IR的表达和ASMC中Ⅲ型胶原的表达。
8、免疫荧光染色:检测ASMC中NK-1R、F-actin、α-tubulin的表达。
9、real time quantitative PCR-检测NK-1R、NK-2R、RhoA、ROCK的mRNA。
10、Western blot:检测NK-IR、NK-2R、α-tubulin、RhoA、ROCK的蛋白表达。
结果:
1、OVA激发时可见到大鼠咳嗽、呼吸困难、喘息,哮喘各组支气管肺泡灌洗液(BALF)q~白细胞计数及嗜酸粒细胞百分比较对照组大鼠明显增加,哮喘2w组即出现气道壁及气道平滑肌厚度增加,羟脯氨酸含量增高,尤以哮喘8w组表现最为明显。布地奈德组和孟鲁斯特组BALF中白细胞及嗜酸粒细胞含量较哮喘8w组明显下降,并能显著抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积,但与对照组比较,气道重塑病理表现仍较显著。
2、哮喘各组较同期对照组气管NK-1R、NK-2R的mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01),且随抗原激发时间的延长,NK-1R、NK-2R的表达增加更明显。布地奈德组和孟鲁斯特组NK-1R、NK-2R的mRNA和蛋白表达较哮喘组减少(P<0.05),但高于对照组(P<0.01)。
3、ASMC中NK-1R、NK-2R的mRNA及蛋白表达与气管组织中的趋势相同,哮喘各组ASMC中NK-1R、NK-2R的mRNA、蛋白表达均高于对照组,以8w组最高(P<0.01).NK-1R主要分布在ASMC的细胞浆和细胞膜。
4、哮喘组大鼠的ASMC与对照组比较细胞增殖显著增快。MTT法测得各时间点的哮喘组ASMC的平均A值均高于对照组,差异有显著性(P<0.05)。NK-1R特异性拮抗剂WIN62577对ASMC的增殖有抑制作用,呈剂量依赖性,WIN6257710-8mol/L组抑制作用最强。
5、哮喘2w、4w、6w、8w组ASMC迁移细胞数目较对照组明显增多,NK-1R拮抗剂组细胞迁移数目较哮喘8w组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05).
6、ASMC中Ⅲ型胶原免疫化学染色显示,棕黄色的Ⅲ型胶原阳性颗粒主要分布在胞浆.哮喘2w、4w、6w、8w组Ⅲ型胶原平均灰度值均高于对照组,以8w组为最显著。NK-1R阻断后,Ⅲ型胶原平均灰度值明显低于未阻断的哮喘平均灰度值,差异有统计学意义(P<0.05)。
7、免疫荧光染色显示,哮喘气道重塑组细胞应力纤维形成增多,F-actin平均灰度值高于对照组;加入NK-1R特异拮抗剂WIN62577或ROCK特异抑制剂Y27632预处理后,应力纤维少见,F-actin平均灰度值减低。
8、α-tubulin免疫荧光染色显示,α-tubulin绿色荧光在ASMC胞质内呈高密度丝网状、放射样由细胞核中心向周边分布。哮喘气道重塑组ASMC中α-tubulin的蛋白表达显著增加,给予NK-1R拮抗剂WIN62577或ROCK.特异抑制剂Y27632预处理哮喘气道重塑大鼠ASMC,则α-tubulin的表达下降。
9、哮喘气道重塑组RhoA、ROCK的mRNA及蛋白的表达显著增加,NK-1R拮抗剂预处理哮喘气道重塑大鼠ASMC,则RhoA、ROCK的mRNA及蛋白的水平下降。
结论:
1、随抗原激发时间的延长哮喘组NK-1R、NK-2R的表达也增加,哮喘组对感觉神经肽的敏感性增高,感觉神经肽受体在哮喘气道重塑的发生中起着重要的作用。
2、感觉神经肽受体的激活是影响ASMC增殖、迁移、合成分泌等生物学特性改变的重要因素之一。
3、哮喘气道重塑大鼠的ASMC存在着微丝、微管骨架重构,NK-1R激活后可能通过RhoA/ROCK信号通路影响细胞骨架的重构,从而在ASMC增殖、迁移、合成分泌等生物学特性中发挥重要作用,促进哮喘气道重塑。