【摘 要】
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蛋白质磷酸化是蛋白翻译后修饰中最重要的一种,调控着多种生物过程,包括细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、DNA损伤应答等。这些基本功能被整合到一个细胞内,形成了一个完整的网
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蛋白质磷酸化是蛋白翻译后修饰中最重要的一种,调控着多种生物过程,包括细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、DNA损伤应答等。这些基本功能被整合到一个细胞内,形成了一个完整的网络。任何微小的变化都可能引发蛋白质磷酸化等一系列反应。这些细胞信号网络在许多疾病如癌症中更为复杂。因此,研究由众多磷酸化蛋白组成的整个信号网络,有利于在系统层面上了解基本的细胞功能以及疾病发展的机制。虽然蛋白质磷酸化在细胞中很普遍,但是它在机体中的化学计量较低,且存在动态性,直接对磷酸化修饰进行研究往往面临着巨大挑战。目前基于质谱对磷酸化肽进行鉴定和定量是非常普遍的,但鉴于磷酸化肽难以离子化等问题,限制了质谱技术在磷酸化蛋白质组学中的应用。因而,在质谱分析前对样品进行预分离和富集是非常必要的。目前众多磷酸化肽段/蛋白富集方法已经被开发,主要有固定金属离子亲和色谱法(Immobilized metal ion affinity chromatography),金属氧化物亲和色谱法(Metal oxide affinity chromatography),强阴阳离子交换色谱法,免疫沉淀法等,其中应用最广泛的方法为IMAC和MOAC。本研究将上述两种方法的长处相结合,首次将Bi3+、Fe3+Zr4+三种离子镶嵌在Ti02上,并在800℃下煅烧形成了一种新型纳米材料800TiO2/Bi/F e/Zr,然后将该新型纳米材料用于富集磷酸化肽。我们首先探究800TiO2/Bi/Fe/Zr复合材料富集磷酸化肽的能力。先用标准磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解物验证该复合材料具有富集磷酸化肽的能力,然后用不同比例的β-酪蛋白与BSA的酶解产物以及HeLa细胞酶解产物,分别探究该复合材料从半复杂样品和复杂生物样品中富集磷酸化肽的能力。结果显示在简单标准品方面,该复合材料可以从中富集到6个磷酸化肽,且该材料富集磷酸化肽的检出限达到2×1 0-10M。对于半复杂样品和生物样品,该材料都具有良好的富集磷酸化肽的能力。其次将800TiO2/Bi/Fe/Zr复合物与Ti02在磷酸化肽富集能力上进行比较。通过标准磷酸化蛋白酶解物,半复杂样品以及复杂生物样品酶解物三个层次进行富集能力比较。结果表明,在简单样品和半复杂样品相同的条件下,800TiO2/Bi/Fe/Zr复合物不仅在富集数量上比TiO2多,还在富集强度上是TiO2的7-8倍。在复杂样品HeLa细胞酶解物中,800TiO2/Bi/Fe/Zr复合物总共富集到564条磷酸化肽段,而TiO2总共富集到345条磷酸化肽段。表明该新型纳米材料相比于TiO2有更好的选择性富集磷酸化肽的能力,暗示800TiO2/Bi/Fe/Zr复合物在磷酸化蛋白质组学中有广泛的应用前景。
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