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目的:
研究两种大型海藻--条浒苔(Enteromorpha clathrata)、羊栖菜(Sargassumfusiforme)不同溶剂提取物对11种水产动物病原菌的抑制活性,利用薄层色谱法(TLC)和色谱柱层析法对海藻中有活性的部分进行分离纯化,并用气相色谱质谱(GC-MS)的方法对活性组分进行检测。
方法:
将新鲜的条浒苔、羊栖菜去除表面杂藻、泥沙等附着物,用蒸馏水清洗去除表面盐分,50℃下烘干,粉碎至40目。取两种海藻粉末各30g分别置于150mL的无水乙醇中,50℃温浴浸提6d,分两次浸提合并提取液,过滤,真空旋转蒸干,得到两种海藻乙醇粗提物,将其分别混悬于10倍的蒸馏水中,充分混悬后用石油醚、乙酸乙酯进行萃取,分别蒸干,各得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水层。
取两种海藻各30g置于索式抽提器中,底部容器分别装入150mL的乙醚、氯仿,分别在45℃和72℃的水浴条件下回流抽提3d,真空旋转蒸干,得到条浒苔乙醚、氯仿粗脂和羊栖菜乙醚、氯仿粗脂。
条浒苔石油醚萃取物进行柱层析分离。柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相的一种层析方法,其固定相选用硅胶(Zcx-Ⅱ型)；经TLC(G型)定性分析确定展开剂为石油醚-乙酸乙酯。
对羊栖菜乙酸乙酯萃取物,分别用薄层色谱法(TLC)和柱层析法分离；薄层层析板采用硅胶G型,柱层析分离采用与条浒苔相同的条件。对于羊栖菜的乙酸乙酯萃取物薄层色谱选用石油醚:丙酮(3:1)作为层析液进行分离,5％乙醇-浓硫酸显色剂显色,通过ZF7A三用紫外分析仪观察,共得6个带；柱层析展开剂选用石油醚-乙酸乙酯。
抗菌实验采用平板扩散法。将各种病原菌接种到2216E液体培养基中,培养18h后,用0.85％无菌生理盐水调节菌液浓度为5.0×106CFU/mL,分别取200μL菌液均匀涂布于2216E固体培养基平板上。将提取物溶解到相对应的浸提溶剂或洗脱剂配成0.1g/ml浓度的药液,用移液枪吸取药液20μL滴于已灭菌的圆形纸片上(Φ6mm)待完全扩散后,晾干,贴于涂布有病原菌的固体培养基平板上,28℃恒温培养24h后,观察并测量抑菌圈的大小。每个样品设2个平行样,结果取平均值。
结果:
1、条浒苔乙醚粗脂对11种水产动物病原菌均表现出了较强的抑制作用,其中对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最强,抑菌圈可达24.7mm；
2、条浒苔乙醚粗脂3种洗脱组分抗菌性均比粗脂减弱了,而其95％乙醇洗脱组分对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可达13.8mm；
3、羊栖菜乙醇粗提物乙酸乙酯部位对溶藻弧菌(Fibrio alginoiyticus)的抑制作用最明显,抑菌圈可达21.6 mm；
4、薄层层析表明羊栖菜乙醇粗提取物乙酸乙酯部位有6条层析带,其中Rf=0.54带对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最强,抑菌圈可达13.6mm；
5、经GC-MS分析,条浒苔石油醚萃取物中抗菌活性物质以8-环己烷-1-酮(18.77％)、1-庚烯-3-酮(14.55％)为主；
6、经GC-MS分析,羊栖菜乙酸乙酯萃取物中抗菌活性物质第5组分以5,5,8a-三甲基萘烷-1-酮(53.82％)、山菊醇(15.67％)为主；第7组分以4-羟基苯甲酸(48.41％)、1,10-癸二醇(11.84％)为主。