研究背景在动脉粥样硬化的形成过程中,IKK/NF-κB信号途径能够被高脂饮食刺激所激活,并通过调控下游靶基因序列,尤其是与炎症相关的基因序列的表达水平,对在动脉粥样硬化形成过程中的的慢性炎症发展过程中起到了重要的调控作用。动脉粥样硬化形成过程中,IKK激酶复合体主要通过与κ3抑制蛋白(IκB)相结合,使其磷酸化及泛素化降解从而游离出NF-κB因子,NF-κB因子进而进入胞核内发挥其转录因子效应,对下游靶基因序列的表达进行调控,在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥其重要调控作用。研究发现动脉粥样硬化病变的严重程度并不能用NF-κB经典通路途径的上游激活物IκB激酶复合物β(IKKβ)的活化来解释。IKKε作为IKK家族的新成员,其能够激活包括NF-κB、干扰素调节因子-3(IRF-3)以及CCAAA/增强子结合蛋白(C/EBPδ)等在内的转录因子,从而调节包括炎症、抗病毒免疫以及细胞生存在内的一系列生物学进程。同时,相关研究表明高脂饮食能促进小鼠肝脏和脂肪组织中核转录因子κB(NF-κB)的活化,引起IκB激酶复合物ε(IKKs)水平的升高。且IKKs基因敲除能消除小鼠肝脏和脂肪组织的慢性炎症。因此,本课题研究高脂饮食所诱导的小鼠动脉粥样硬化形成过程中IKKs的调控作用,并进一步探讨IKKs是否通过NF-κB信号转导通路的表达变化来调控高脂饮食所诱导的小鼠动脉粥样硬化病变的发展。研究方法通过将C57BL/6野生型小鼠或IKKε基因敲除小鼠与载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠进行杂交,并提取小鼠DNA进行PCR扩增,然后行凝胶电泳对各组小鼠的基因型进行鉴定。共得到四种不同组别的实验小鼠：(1)野生型组小鼠；(2) IKKε基因敲除组小鼠；(3) ApoE基因敲除组小鼠；(4) IKKε/ApoE双基因敲除组小鼠。每组小鼠各16只,自八周龄起接受高脂饮食喂养,12周后处死小鼠,留取血液及组织标本。通过免疫组化及Western Blotting方法对各组间小鼠主动脉根部组织的IKKε的蛋白水平表达及定位进行研究。通过免疫荧光方法对IKKp的蛋白表达水平及定位进行研究。通过体重及血脂分析的检测观察各组小鼠间代谢指标的基本变化情况。通过苏木素-伊红染色(HE)观察各组小鼠主动脉根部组织的形态学变化。通过油红O染色分别对各组小鼠主动脉根部组织及全长胸主动脉大体标本进行脂质沉积状况的检测。通过扫描电镜对各组小鼠主动脉根部血管壁的超微结构进行观测。通过免疫组化对包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在内的炎症因子的蛋白水平表达及定位进行研究。通过免疫共沉淀方法对IKKs与NF-κB的主要组成成分P50及P65之间的相互作用关系进行研究。通过Western Blotting及免疫荧光方法对各组小鼠主动脉根部组织的NF-κB信号转导通路各主要组成成分的蛋白表达水平及定位进行研究。通过Western Blotting方法及免疫荧光方法对NF-κB信号转导通路下游的效应因子：血管内皮生长因子(VEGF)及白介素-18(IL-18)的蛋白表达水平及定位进行研究。研究结果通过对小鼠DNA的PCR扩增及凝胶电泳分析,我们对于小鼠基因型的纯合性有了明确的验证。通过Western Blotting的研究方法,我们发现,ApoE单敲组的小鼠中IKKε的表达水平较野生型组有了显著的升高。通过免疫组织化学的方法进一步得出了相同的结论,即在ApoE单敲组的小鼠中,IKKε的表达水平较野生型组有了显著的升高,且增多的IKKε主要分布于主动脉管壁的内膜层中。通过免疫荧光的研究方法,我们发现,四组小鼠主动脉血管壁内的IKKβ的蛋白水平表达均处于较低水平,彼此之间并无明显统计学差异。通过体重及血脂分析的检测,我们发现野生型组及IKKε单敲组小鼠的体重及血脂水平并无显著差异,但与野生型组相比,ApoE单敲组的小鼠的体重及血脂水平均存在显著提高,IKKε/ApoE双敲组小鼠的体重增长较ApoE单敲组的小鼠显著偏低,与野生型组及IKKε单敲组相似；而IKKε/ApoE双敲组小鼠的血脂增长则与ApoE单敲组相似,无明显差异,均显著高于野生型组及IKKε单敲组。通过HE染色可以观测到ApoE单敲组小鼠主动脉管壁内的粥样硬化病变较为严重,与之相比IKKε/ApoE双敲组小鼠的病变较轻,与野生型组及IKKε单敲组相似。主动脉根部血管壁组织冰冻切片和全长大体胸主动脉的油红O染色显示,在IKKε/ApoE双敲组中,油红O染色阳性的区域较ApoE单敲组明显减少,但与野生型组及IKKε单敲组相比则明显增多。扫描电镜显示IKKε/ApoE双敲组小鼠的内膜完整性较而ApoE单敲组好,且在ApoE单敲组小鼠的主动脉管壁中,我们可以观测到单核细胞粘附及迁移至内膜层的现象。通过免疫荧光的研究方法,我们发现在ApoE单敲组的小鼠中,其血管壁内的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达量均较IKKε/ApoE双敲组明显升高,且增多的阳性信号表达主要位于主动脉管壁的内膜层。通过免疫共沉淀的方法,我们明确了IKKε与P50和P65之间存在着密切的相互作用关系。通过Western Blotting和免疫荧光的研究方法,我们发现,IKKε/ApoE双敲组小鼠的主动脉管壁内P50和P65的蛋白水平表达较ApoE单敲组明显减少。与此同时,其蛋白水平表达与野生型组及IKKε单敲组相比,无明显差异,均保持在一个较低的水平。同时,在IKKε/ApoE双敲组小鼠的主动脉管壁内,P50和P65主要广泛定位于各种不同细胞的胞浆内；而在ApoE单敲组中,P50和P65的定位由细胞浆内广泛表达转移至细胞核中,尤其更多地分布于内膜区域。对磷酸化的P50和P65的蛋白水平表达的检测的结果与之相符。通过对IκB-α的蛋白水平表达的检测,我们发现IKKε/ApoE双敲组小鼠的主动脉管壁内IκB-α的蛋白水平表达较ApoE单敲组明显增多,这一结果完全与P50和P65的蛋白水平表达相反。同时,其蛋白水平表达与野生型组及IKKε单敲组相似,均明显高于ApoE单敲组。通过Western Blotting以及免疫荧光方法对两个NF-κB的下游重要效应因子——IL-18和VEGF的蛋白水平表达的检测结果与P50/P65及磷酸化P50/P65基本相一致,均为IKKε/ApoE双敲组明显低于ApoE单敲组,且在IKKε/ApoE双敲组小鼠的主动脉管壁内,IL-18和VEGF主要广泛定位于各种不同细胞的胞浆内；而在ApoE单敲组中,IL-18和VEGF的定位由细胞浆内广泛表达转移至细胞核中,尤其更多地分布于内膜区域。结论通过构建高脂饮食所诱导的小鼠动脉粥样硬化模型,对各组小鼠主动脉壁内IKKε以及NF-κB信号转导通路各主要组成成分的蛋白表达及定位的表达变化进行研究,并对各组小鼠动脉粥样硬化慢性炎症损伤病变的程度进行检测,我们阐明了IKKε的激活在高脂饮食所致的动脉粥样硬化损伤中具有重要的调控作用,且这一调控作用主要是通过NF-κB信号转导通路的激活而发挥其生物学效应的。