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HtrA是一种热休克诱导的膜丝氨酸蛋白酶,HtrA1是人类HtrA丝氨酸蛋白酶家族中第一个被发现的,是一种外分泌蛋白,能够降解细胞外基质(ECM)蛋白,包括纤粘连蛋白和层粘联蛋白、胶原和弹性蛋白等,HtrA1还能与蛋白聚糖、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等相结合,发挥其水解基质蛋白的作用。HtrA1能抑制成纤维细胞的表型转化,抑制细胞的生长和增殖,同时也是一种能够抑制肿瘤表达的基因。HtrA1蛋白广泛结合于转化生长因子β(TGF-β)蛋白家族,抑市(?)TGF-β/Smads信号通路介导的信号传导。2009年研究发现HtrA1基因是临床罕见病-伴有皮质下梗死和白质病变的常染色体隐性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leucoencephalopathy, CARASIL)的致病基因,该基因有9个外显子,已发现6个突变位点,均位于HtrA1丝氨酸蛋白酶的活性区。该基因突变能导致HtrA1蛋白酶的活性减低,蛋白表达下调,对TGF-β信号通路的抑制降低,TGF-β/Smads表达上调,导致ECM生成过多并过度沉积。CARASIL是一种青年期发病的神经系统病隐性遗传性脑血管病,以早发的痴呆、卒中、腰椎关节病变、脱发为主要临床表现；头颅影像学检查表现为脑部CT或MRI扫描表现为双侧大脑半球脑室旁深部白质对称性病变及多发性皮质下梗死,CARASIL的病理改变可观察到脑部小动脉内膜增厚、内弹力纤维断裂、中膜玻璃样变、中膜平滑肌细胞丢失、外膜明显菲薄及内膜增厚所导致的管腔向心性狭窄等类似小动脉硬化的表现。有关该基因突变导致CARASIL的具体发病机制目前尚不清楚。2006年我们报道了国内第一个CARASIL的家系,并通过基因检测分析发现了HtrA1基因一个新的突变位点：1091T>C点突变,属错义突变,该突变具有很强的致病性。这为我们研究CARASIL的发病机制提供了较好的研究平台,前期的课题研究发现,将该位点的HtrA1突变基因转染进血管平滑肌细胞后能导致HtrA1mRNA以及蛋白表达减少,并能引起TGF-β/Smads信号通路的表达上调。为进一步研究CARASIL病理改变中外膜明显菲薄、中膜平滑肌细胞丢失及内膜增厚的发病机理,本课题选择研究血管外膜成纤维细胞的表型结构和分泌功能的变化在HtrA1基因突变致CARASIL发病过程的作用,并建立一个HtrA1野生型及突变型基因的血管外膜成纤维细胞的表达模型,研究TGF-β/Smads/CTGF信号通路的变化,进一步在细胞水平及分子水平探讨CARASIL血管病变的发病机制。第一部分HTRA1基因慢病毒表达载体的构建包装研究目的：构建针对HTRA1基因的慢病毒表达载体以及HTRA11091T>C突变基因(HTRA1-Mut)的慢病毒表达载体,并将两种载体转染进血管外膜成纤维细胞。研究方法：根据人HTRA1基因的序列设计一对引物,Primer Forword:5-GGAATTCAT GCAGATCCCGCGCGCC-3, Primer Reverse:5-CGGGATCCCTATGGGTCAATTTCT T-3。PCR扩增目的基因,pLenO-GTP载体、HTRA1和HTRA1-Mut基因PCR产物使用EcoRI和BamHI进行酶切,将pLenO-GTP载体酶切产物和HTRA1和HTRA1-Mut基因的PCR产物加样到1%的琼脂糖胶,回收含有目的DNA的琼脂糖凝胶,洗脱目的DNA,将HTRA1和HTRA1-Mut基因目的片段与慢病毒表达载体(pLenO-GTP)连接后转化大肠杆菌,抽提质粒后用EcoRI和BamHI双酶切后琼脂糖电泳及质粒测序验证,构建HTRA1和HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体。采用四质粒系统的慢病毒载体系统(Tronolab),四种质粒载体进行高纯度无内毒素抽提,采用磷酸钙-DNA共沉淀法转染进293T细胞,采用倍比稀释法检测病毒滴度。结果：通过PCR扩增获得了野生型HTRA1基因及突变型HTRA1基因的目的片段,将HTRA1克隆到慢病毒表达质粒载体pLenO-GTP中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。测定病毒滴度：GTP-HTRA1滴度为5.1×108TU/ml, GTP-HTRA1-Mut滴度为8.6×108TU/ml。结论：成功构建了HTRA1野生型基因及突变型HTRA1基因慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨HTRA1蛋白的功能奠定了基础,也为建立起HTRA1突变基因的血管外膜成纤维细胞的表达模型奠定基础。第二部分HTRA1基因慢病毒载体转染血管外膜成纤维细胞模型的建立研究目的：将构建好的HTRA1野生型基因及突变型基因的慢病毒表达载体转染进血管外膜成纤维细胞,观察突变基因对成纤维细胞增殖活性和迁移活性的影响。研究方法：将进口人脑血管外膜成纤维细胞(AF)进行传代培养,用FM培养基培养AF,将培养的第1代AF应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等,行纤维连接蛋白(fibronectin, FN)和波形蛋白(vimentin)以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫荧光细胞化学染色的方法来鉴定培养的细胞。取生长良好的第4代细胞用于慢病毒感染。感染分三组进行：(1)野生型HTRA1基因组(HTRA1):（2）突变型HTRA1基因组（HTRA1-Mut）；（3）空载体对照组。用CCK-8法检测细胞的增殖活性，用Transwelll小室来检测细胞的迁移活性。结果：消化传代培养的成纤维细胞呈梭形、星形、多角形或不规则形状，呈典型的成纤维样细胞形态。FN和vimentin抗体鉴定结果阳性，ɑ-SMA抗体结果阴性，证实培养的细胞为血管外膜成纤维细胞。慢病毒载体感染细胞48-72小时后细胞有绿色荧光表达，表明已经成功转染。野生基因组细胞的增殖活性及迁移活性均低于突变基因组细胞。结论：1、HTRA1野生型及突变型基因慢病毒表达质粒载体成功感染血管外膜成纤维细胞，能够建立起HTRA1基因的细胞表达模型。2、HTRA1基因突变后对AF的生长增殖及迁移活性的抑制作用均减弱。第三部分HTRA1基因在血管外膜成纤维细胞的表达以及对其分泌功能的影响研究目的：检测野生型HTRA1基因及突变型HTRA1-Mut基因转染进血管外膜成纤维细胞后的HTRA1mRNA及HTRA1蛋白的表达以及突变基因对成纤维细胞分泌功能的影响。研究方法：细胞转染48小时后，收集野生基因组、突变基因组及对照组三组细胞的培养上清液。用ELISA法测上清液中细胞外基质（ECM：纤维连接蛋白、层黏连蛋白、胶原Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型）的含量。提取细胞的总RNA及总蛋白，分别用RT-PCR及Westernblot从转录及翻译的水平检测三组细胞的HTRA1mRNA及蛋白的表达，并检测三组细胞ɑ-SMA、OPN的mRNA表达的差异。结果：RT-PCR检测三组细胞的HTRA1mRNA的表达，HTRA1野生基因组HTRA1mRNA表达高于HTRA1-Mut突变组，对照组最低。ɑ-SMAmRNA及OPNmRNA在HTRA1-Mut突变组表达最高，野生基因组次之，对照组最低。Westernblot检测三组细胞HTRA1蛋白的表达，HTRA1野生基因组HTRA1蛋白表达高于HTRA1-Mut突变组，对照组最低。结论：HTRA1突变型基因(1091T>C)转染血管外膜成纤维细胞后能在细胞内成功表达，基因突变后导致HTRA1mRNA以及HTRA1蛋白表达减少，对成纤维细胞分泌功能的抑制作用减弱，成纤维细胞表达ɑ-SMAmRNA及OPNmRNA上调。关键词：血管外膜成纤维细胞，HTRA1，mRNA，RT-PCR，Westernblot第四部分HTRA1基因突变对血管外膜成纤维细胞TGF-β/Smads/CTGF信号通路的影响研究目的：检测HTRA1野生型及突变型基因转染血管外膜成纤维细胞后对TGF-β/Smads/CTGF信号通路的影响。研究方法：细胞转染48小时后，收集野生基因组、突变基因组及对照组三组细胞，提取细胞的总RNA，用RT-PCR的方法检测三组细胞的TGF-β1、Smad2、Smad3、CTGF的mRNA表达的差异。结果：各组细胞RT-PCR结果显示，突变基因组TGF-β1、Smad2、Smad3、CTGF的mRNA表达量最高，野生基因组次之，对照组最低。结论：HTRA1突变型基因(1091T>C)转染血管外膜成纤维细胞后对TGF-β/Smads/CTGF信号通路的抑制作用减弱，引起TGF-β/Smads/CTGF信号通路表达上调。