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第一部分ERAP1单核苷酸位点与山东地区子痫前期孕妇遗传学放大验证的关联研究目的:课题组前期通过外显子组重测序关联分析发现内质网氨基肽酶1（Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1,ERAP1）基因三个单核苷酸多态性位点（rs30187,rs27044和rs469783）与子痫前期发生相关。为进一步探究ERAP1是否为子痫前期的遗传易感因素,我们在山东人群中遗传学放大验证这三个位点与子痫前期发生的相关性。方法:依托课题组前期建立的子痫前期标本库,以990名子痫前期患者为病例组,1240名健康孕妇为对照组,从收集到的外周血样本中提取DNA,通过Taqman探针荧光PCR技术进行这三个位点的基因型分型。同时,随机选取每个位点的10例样本进行PCR扩增,采用一代测序技术验证探针基因分型的准确性。应用SPSS26.0进行病例组和对照组间关联研究的统计分析。结果:1.病例组和对照组的临床数据分析显示两组间临床资料如分娩孕周、孕期增加体重、收缩压、舒张压、白细胞、甘油三酯等存在统计学差异（P＜0.05）,而中性粒细胞计数、流产次数无明显差异（P＞0.05）。2.对于rs30187位点来说,病例组和对照组的遗传学分布存在统计学差异（基因型:c2=29.246,P＜0.0001;等位基因:c2=4.682,P=0.03,OR=1.060,95%CI=1.005~1.118）;rs27044位点在两组间的基因型分布存在统计学差异（c2=28.949,P＜0.0001）,而等位基因频率分布差异不明显（c2=2.306,P=0.129,OR=1.054,95%CI=0.985~1.128）;rs469783位点的基因型和等位基因频率分布在两组间均存在明显差异（基因型:c2=7.012,P=0.03;等位基因:c2=6.452,P=0.011,OR=1.082,95%CI=1.018~1.150）。对这三个位点的显性基因和隐性基因模型进行遗传学分析,发现rs30187和rs27044均是隐性基因模型在两组间存在统计学差异,且在两个位点上均是CC基因型增加了子痫前期的发病风险（rs30187:c2=20.817,P＜0.0001,OR=1.380,95%CI=1.200~1.587;rs27044:c2=19.966,P＜0.0001,OR=1.518,95%CI=1.261~1.827）,而对于rs469783位点,其显性基因模式在两组间表现出统计学差异（c2=5.823,P=0.016,OR=0.836,95%CI=0.723~0.968）,基因型CC是子痫前期发病的保护性因子。3.分析基因型与临床表型的相关性发现rs30187和rs27044的基因型和舒张压具有相关性（F=6.923,P＜0.0001;F=4.460,P=0.004）而rs469783位点与临床表型无明显相关性。结论:ERAP1与子痫前期的遗传易感性相关,rs30187和rs27044位点CC基因型的携带者患有子痫前期的风险更高,而rs469783位点的CC基因型是子痫前期发生的保护性因子。第二部分ERAP1错义变异体参与子痫前期发病机制的研究目的:内质网氨基肽酶1（Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1,ERAP1）能够在体外催化血管紧张素II转化为血管紧张素III和IV,参与血压的调节,可能在子痫前期的发病中起作用。本研究第一部分表明ERAP1单核苷酸位点与子痫前期有关。因此,本研究通过构建该基因错义变异体进行细胞与分子等体外实验,初步探讨ERAP1在子痫前期的分子致病机理。方法:构建野生型质粒并以野生型质粒为模版,设计点突变引物来构建两种错义变异质粒:rs30187（K528R）、rs27044（E730Q）。转染si RNA-scramble（作为对照组）、si RNA-ERAP1、pc DNA3.1+空载质粒、ERAP1野生型质粒、ERAP1-c.1583T＞C变异型质粒和ERAP1-c.2188G＞C变异型质粒至Htr8细胞中,提取细胞RNA及蛋白,检测ERAP1的表达水平,并通过细胞相关功能实验如细胞划痕、Transwell迁移侵袭、CCK-8细胞增殖实验以检测不同转染组对细胞功能的影响。统计学方法采用两独立样本t检验,当P＜0.05时认为两组间存在统计学差异。结果:1.细胞转染si RNA-ERAP1后,与对照组相比:ERAP1的表达在m RNA和蛋白水平上均明显下降（m RNA:P=0.0017,蛋白:P=0.0482）,表明转染目的基因的si RNA能够敲低基因的表达。2.敲低目的基因后:细胞在450nm下吸光值明显下降（P=0.0458）,说明细胞增殖能力受到抑制;划痕48h后细胞迁移率明显下降（P=0.0309）,24h穿过transwell小室的细胞数量明显下降（P=0.0302）,表明敲低组的细胞迁移能力下降;24h穿过含基质胶transwell小室的细胞数量明显减少（P=0.0464）,表明细胞的侵袭能力受到抑制。3.转染野生型质粒至细胞后,与转染空载组相比,ERAP1的m RNA（P=0.0003）和蛋白（P=0.0076）表达明显上升,表明野生型质粒对目的基因起到了过表达的作用。转染变异型质粒ERAP1-c.1583T＞C和ERAP1-c.2188G＞C后,与转染野生型质粒的细胞相比,目的基因的m RNA表达明显下降（c.2188G＞C:P=0.0003;c.1583T＞C:P=0.0004）,蛋白表达明显下降（c.2188G＞C:P=0.0033;c.1583T＞C:P=0.006）,表明这两种错义变异能够下调目的基因的表达。4.细胞过表达目的基因后:细胞的增殖能力增强（P＜0.0001）;细胞划痕48h后迁移率升高（P=0.0015）,24h穿过transwell小室的细胞数量增多（P=0.001）,表明细胞的迁移能力增强;transwell侵袭实验表明细胞侵袭能力增强（P=0.0001）。转染两种错义变异质粒到细胞后,与过表达组相比:细胞的增殖能力受到抑制（c.2188G＞C:P＜0.0001;c.1583T＞C:P＜0.0001）;transwell小室细胞穿过的数量明显下降（c.2188G＞C:P=0.0013;c.1583T＞C:P=0.0318）,划痕48h后细胞迁移率均表现出下降趋势,转染ERAP1-c.2188G＞C质粒的下降趋势存在统计学差异（P=0.0043）,而转染ERAP1-c.1583T＞C质粒的下降趋势不明显（P=0.0985）;细胞的侵袭能力下降（c.2188G＞C:P＜0.001;c.1583T＞C:P=0.0227）。结论:ERAP1对细胞的增殖,迁移和侵袭能力起促进作用,然而两种错义变异ERAP1-c.1583T＞C和ERAP1-c.2188G＞C会降低目的基因的表达并且对细胞的迁移侵袭能力产生抑制作用。因此我们推测ERAP1作为子痫前期的遗传易感因素可能是通过影响滋养层细胞的迁移侵袭能力参与子痫前期的发病机制。