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低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharides,IMOs）是葡萄糖单元以至少一个α-1,6糖苷键连接形成的聚合度在2～10之间的寡糖混合物,主要成分是异麦芽糖,异麦芽三糖（isomaltotriose,IG3）和潘糖等。IMOs不易被人体消化酶利用,具有低血糖指数特征,可用于糖尿病患者的健康糖替代品。此外,IMOs还可被肠道益生菌双歧杆菌分解利用,产生短链脂肪酸,抑制肠道有害菌生长,因此被广泛应用于食品等行业。研究表明IMOs对双歧杆菌的增殖作用主要归因于以三糖为主的高聚合度的组分。因此本研究提出以淀粉质原料为底物,使用4,6-α-葡萄糖基转移酶（4,6-α-glycosyltransferases,4,6-α-GTs）合成右旋糖酐,再使用异麦芽三糖右旋糖酐酶（isomaltotrio-dextranase,IMTD）降解右旋糖酐制备IMOs的两步法工艺以提高IMOs的产率和IG3的比率。选择来源于Brevibacterium fuscum的IMTD（BfIMTD）进行重组表达,并对BfIMTD特征结构进行探究,以揭示决定BfIMTD外切特征的规律。同时优化两步法工艺路线,针对合成反应,选用Lactobacillus fermentum来源的4,6-α-GT（LfGT）与普鲁兰酶、异普鲁兰酶进行复配以提高中间产物右旋糖酐的产率（峰面积）和α-1,6糖苷键比例;针对降解反应,优化BfIMTD降解右旋糖酐的工艺以实现富含IG3的IMOs的高效制备。主要研究结果如下:（1）BfIMTD的重组表达及酶学性质研究。构建重组菌Escherichia coli BL21（DE3）/p ET-24a（+）-Bfimtd以对BfIMTD进行重组表达。在25℃,200 r·min-1的条件下添加0.6 mmol·L-1的IPTG对重组菌E.coli BL21（DE3）/p ET-24a（+）-Bfimtd诱导发酵48 h,酶活为7.8 U·m L-1。对粗酶液进行镍离子螯合层析,获得电泳纯的BfIMTD,比活为78.7 U·mg-1,纯化倍数为8.4倍,回收率为31.7%。重组BfIMTD的最适温度是45℃,最适p H是8.0,以0.1 g·m L-1商品化右旋糖酐20000为底物,反应0.5 h,IG3在产物中的比例可达91.5%。（2）BfIMTD的外切特征研究。对BfIMTD和同家族的右旋糖酐酶进行序列比对及模拟结构分析。与同家族右旋糖酐酶相比,BfIMTD在第392～400位多出氨基酸序列片段GEKEIGV,该片段在空间结构上构成一段部分螺旋的无规则卷曲结构(简称loopexo),限制了催化凹槽的延伸。对BfIMTD进行loopexo截短突变获得突变体BfIMTD-ΔL,在大肠杆菌中表达,诱导发酵48 h,酶活为0.7 U·m L-1。BfIMTD-ΔL水解商品化右旋糖酐20000,产物为含微量IG3的异麦芽寡糖混合物,外切特征消失,表明loopexo结构对BfIMTD的外切特征至关重要。其次,挖掘生物数据库中具有loopexo特征的蛋白序列,选择Cellulosimicrobium cellulans和Mycetocola reblochoni来源的右旋糖酐酶Cc Dex和Mr Dex,以截短的Cc DexΔBC和Mr DexΔBC进行重组表达和酶学定性验证loopexo的作用。结果表明,模型酶水解0.1 g·m L-1商品化右旋糖酐20000,IG3在产物中的比例分别为84.3%和92.1%,表明Cc DexΔBC和Mr DexΔBC是典型的外切型右旋糖酐酶,进一步证明loopexo结构是此类右旋糖酐酶外切特征的决定因素。（3）基于LfGT和BfIMTD的右旋糖酐合成降解两步法制备IMOs研究。对LfGT合成右旋糖酐步骤进行优化,当p H为6.0,温度为37℃,LfGT加酶量为400 U·g-1底物时,右旋糖酐在产物中（峰面积）比例为24.3%,α-1,6糖苷键的比例为76.0%;在上述条件下同时添加普鲁兰酶,加酶量为40 U·g-1底物时,右旋糖酐在产物中（峰面积）比例为73.1%,α-1,6糖苷键的比例为89.3%,双酶复配显著提高了右旋糖酐的比例和α-1,6糖苷键比例;在上述条件下同时添加异普鲁兰酶,加酶量为400 U·g-1底物时,右旋糖酐在产物中（峰面积）比例为66.3%,α-1,6糖苷键的比例为99.3%,与双酶复配相比,三酶复配右旋糖酐的比例略有下降,但α-1,6糖苷键比率显著提升;将三酶复配的右旋糖酐产物,经酵母消化除去葡萄糖后冷冻干燥,获得两步法中间产物右旋糖酐。在降解步骤中,选用α-1,6糖苷键比例为99.3%的三酶复配制备右旋糖酐作为底物,当p H为7.5,温度为40℃,右旋糖酐浓度为0.1 g·m L-1时,加酶量为150 U·g-1的BfIMTD,反应10 h时,IG3可达到最高浓度98.3 g·L-1。两步法IG3最终产率为65.2%。