中枢性性早熟(centralprecociouspuberty，CPP)是下丘脑-垂体-性腺轴提前发动，性腺发育，分泌性激素，使患儿骨生长板过早性激素暴露(接触)，骨成熟加速-骨龄提前，使青春期生长时间缩短而对成年身高带来负面影响，成年身高不能达到遗传靶身高(targetHeight，THt)。改善成年身高是CPP治疗的y要目标之一，理想的药物应能促进长骨生长/成熟的正平衡。促性腺激素释放激素拟似物(gonadotropinreleasinghormorleagonist，GnRHa)是近年用于改善中枢性性早熟患儿成年终身高的丰要药物，它因能有效抑制性腺发育，性激素分泌减少而延缓骨龄增长，但治疗过程中可致牛长减速，减速严重者可而成为影响疗效的症结。目前主要应用基因重组生长激素(recombinantgrowthhormone，rhGH)克服减速，但其价格极其昂贵。蛋白同化类固醇激素(anabolic-androgenicsteroids，AS)能促进长骨线性生长，但应用不当时可使骨成熟加速，对终身高呈负面影响，其机制未明。本研究以GnRHa处理的青春期个体为对象，以注射了GnRHa的青春期大鼠生长板的软骨细胞进行离体和在体动物实验，以及CPP患儿的临床研究，探讨蛋白同化类固醇激素对青春期发育个体GnRHa处理后对生长的影响及其机制，为寻求生长激素以外克服GnRHa治疗中生长减速有效、安全而且经济的另一临床治疗选择奠定理论基础。 第一部分蛋白同化类固醇激素对GnRHa处理后青春期大鼠生长板软骨细胞增殖和分化的影响及机制探讨 (一)目的: (1)探索高效合理的大鼠长骨生长板软骨细胞分离方法和体外培养条件，建立一种理想的软骨细胞体外培养体系。对分离培养的软骨细胞的形态和生长特性进行观察，为进一步实验提供条件。 (2)应用AS制剂司坦唑醇(stanozolol，ST)研究其对离体培养的GnRHa处理后青春期大鼠生长板软骨细胞的增殖、成熟和分化的影响。探索ST促进生长/成熟正平衡的量、时效关系。 (3)离体研究司坦唑醇对GnRHa处理后青春期大鼠与促进生长有密切关系的生长板软骨细胞胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA表达和IGF-1合成分泌的影响。 (4)离体实验探索司坦唑醇经由雌激素受体α(ERα)、雄激素受体(AR)、IGF-1受体(IGF-1R)介导软骨细胞增殖/分化的途径，以及两种受体与生长因子受体后信号通路的交互影响(cross-talk)，以探讨ST促进骨生长/成熟生物效应的分子层面的可能机制。 (5)通过分子动力学模拟方法预测司坦唑醇与ERα的相互作用方式，探讨ERα与司坦唑醇和雌二醇相互作用方式的同异。 (二)材料和方法:1.软骨细胞的分离与培养鉴定雌鼠3周龄末时断乳并开始肌注GnRHa制剂曲普瑞林，每2周一次，共2次，7周末时处死，无菌取出胫骨生长板。采用二次酶消化法获得软骨细胞，观察软骨细胞生长特性，行软骨细胞鉴定并绘制生长曲线，选择处于对数生长期的原代细胞用于实验研究。 2.司坦唑醇对体外培养GnRHa处理后青春期大鼠生长板软骨细胞增殖和成熟分化的影响将原代软骨细胞接种于96孔板和24孔板，常规培养48小时后进行细胞饥饿24小时，之后时效组(0、1、2、3、4、5天)中ST组培养基内加入司坦唑醇(终浓度10-8M)分别培养，量效组于培养液中加入不同浓度的ST(0、10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M)作用48小时，通过MTT法和免疫组化法检测软骨细胞核增殖细胞核抗原(PCNA)、胞浆中II型胶原(软骨细胞增殖指标)、X型胶原(软骨细胞分化成熟指标)的表达，了解司坦唑醇对软骨细胞增殖的影响和时效、量效的关系。 3.司坦唑醇对GnRHa处理后青春期大鼠生长板软骨细胞IGF-1mRNA表达及其蛋白合成分泌的影响按3×105个细胞/皿的密度将原代软骨细胞悬液接种于35mm的培养皿，于接种72小时后首次更换培养基，之后每2天更换1次至70～80％融合，再用无血清培养液培养24小时，次日进行ST干预。按时效组和量效组不同时间行ST剂量处理，IGF-1mRNA表达时效组ST浓度均为10-7M，于0、2～16小时共6个时间点，量效组(0、10-11IM～10-5M，8个浓度点)作用时间8小时，完成处理后收取各组的细胞进行荧光实时定量RT-PCR检测IGF-1mRNA。 IGF-1蛋白合成分泌时效组ST浓度均为10-7M，于0、5～40小时共6个时间点，量效组(0、10-11M～10-5M，8个浓度点)作用时间20小时，完成处理后取细胞上清液浓缩后以ELISA法测定IGF-1，并对贴壁细胞进行计数。 4.IGF-1R、ERα和AR-受体后信号及其间交联作用对ST促进软骨细胞增殖分化机制的研究将原代软骨细胞接种于96孔培养板及24孔板，分别用4个阻断剂，AR阻断剂(BIC)、ER阻断剂(ICI182.780)、IGF-1受体(IGF-1R)阻断剂(AG1024)、丝裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKK)阻断剂(PD98059)。每个阻断剂设置三个浓度。常规培养72小时后换成0.02％无激素胎牛血清的培养液进行细胞饥饿，饥饿24小时后预先在ST+阻断剂组、单纯阻断剂组中加入各阻断剂后再在单纯ST组、ST+阻断剂组再加入ST(司坦唑醇最终浓度为10-8M)，无药对照组则继续用0.02％胎牛血清培养液。常规培养72小时后取出进行MTT比色及PCNA免疫组化。 5.分子动力学模拟方法对司坦唑醇与雌激素受体α相互作用方式的研究依据已知的雌激素受体蛋白ERα的三维晶体结构，通过基于AMBER立场的分子动力学模拟方法来预测雌激素受体α与司坦唑醇的相互作用方式，使用MM-PBSA方法模拟计算雌激素受体α和司坦唑醇的结合自由能，并从动力学的角度探索并解释了雌激素受体蛋白ERα与小分子相互作用和识别机制。 第二部分蛋白同化类固醇激素对GnRHa处理后青春期大鼠生长影响的实验研究 (一)目的:经在体动物研究，观察GnRHa处理后的青春期大鼠ST对软骨生长板的生长和成熟的影响，探索ST促进长骨生长和成熟平衡的量、时效关系。 (二)材料和方法:正常清洁级SD雌鼠3周龄末时断乳，量效组按随即区组(同窝)设计(每窝7只)分为7组(6只/组)，分别为5000ug/100g、200ug/100g、100ug/100g、50ug/100g、25ug/100g、溶剂对照组、空白对照组。时效组按随即区组(同窝)设计(每窝8只)分为8组(6只/组)分别为：2天组、3天组、5天组、7天组、10天组、13天组、溶剂对照组、空白对照组。并开始肌注GnRHa，每2周一次，共2次，在第二次注射GnRHa3天(D1)后开始干预处理：(1)量效组于D1～D13分别每日注射相应剂量的ST。(2)时效组按疗程长短分别于D1～D13(13天组)、D1～D10(10天组)、D1～D7(7天组)、D1～5(5天组)、D1～3(3天组)、D1～2(2天组)接受剂量为100ug/100gST注射处理。溶剂对照组于D1～D13只接受等量注射大豆油，空白对照组不进行任何处理。所有大鼠于D14处死。比较接受不同处理的大鼠体重增长、鼻肛长度增长、胫骨长度、胫骨生长板HE染色进行生长板的宽度、增殖区的宽度、肥大区宽度、增殖区软骨细胞数、肥大区软骨细胞数的分析、PCNA免疫组化半定量分析及血清IGF-1浓度检测。 第三部分(临床部分) (一)目的:临床研究(1)探讨不完全性CPP(又称单纯性乳房早发育)向完全性CPP转化的相关风险因素。 (2)前瞻分析CPP患儿在GnRHa治疗中出现生长减速时司坦唑醇对克服减速的疗效。 (二)材料和方法:1对象和方法纵向回顾分析中山大学附属第一医院1995-2005近十年确诊为PT的151例患儿的临床及实验诊断资料中与转化相关的因素。 2对象和方法分析在我院确诊特发性CPP并接受了曲普瑞林(达菲林)治疗的女性患儿30例，分3组，①单独GnRHa组②GnRHa+ST组③GnRHa+GH组。GnRHa+ST组为前瞻性研究，单独GnRHa组和GnRHa+GH为回顾配对组，配对原则是在曲普瑞林治疗过程中均出现生长减速(GV<4cm/年)，且骨龄达10.5～14岁。达菲林50～100μg/kg，每隔28天一次。ST30μg/kg/d，连续服用三个月后停三个月；GH采用金磊赛增(长春金赛药业有限责任公司)，剂量1U/kg.w，分6～7次，睡前皮下注射；单独达菲林治疗组在出现减速后继续应用达菲林，不加任何药物。观察时间为从研究开始共6个月。比较各组研究前后乳房大小及阴毛发育情况、生长速度的改变、骨龄进展情况、按骨龄判断的身高标准差分值(HtSDSba)、预测成年身高(PAH)、按遗传靶身高的预测成年身高标准差分值(PAHSDSTHt)。