家蝇幼虫抗病毒蛋白的分离纯化及其生物活性研究

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本文以家蝇幼虫为研究对象,在实验室前期研究基础上,采用色谱分离方法和分析鉴定技术从家蝇幼虫体内分离纯化获得了抗病毒活性蛋白(HAP),测定了其抗病毒活性、清除自由基和淋巴细胞增殖活性,并对其分子构象表征进行了初步解析,同时还研究了中间产物家蝇幼虫清蛋白的抗生物氧化、免疫药理活性以及副产物几丁糖的抗氧化、抗真菌、抗肿瘤活性,为家蝇幼虫的深层次综合开发利用提供了实验基础,主要研究结果如下:  1.家蝇幼虫清蛋白的抗病毒和抗氧化活性研究  在实验室前期研究的基础上,测定了家蝇幼虫清蛋白对两种昆虫病毒(AcMNPV和BmNPV)的抗病毒活性。实验结果表明,家蝇幼虫清蛋白对AcMNPV具有良好的抗病毒活性,并能显著降低家蚕病毒BmNPV对家蚕的侵染能力。非脂质体系抗氧化、体外、体内抗生物氧化等实验结果表明家蝇幼虫清蛋白还能有效清除自由基和减弱肝组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化反应,抑制机体红细胞氧化溶血,保护细胞膜结构和功能的完整,避免细胞受损伤,并能显著地降低老龄小鼠肝匀浆和血清中的脂质过氧化产物MDA的含量,对机体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力也具有显著的增强作用,显示出良好的抗氧化性能和延缓衰老的作用。  2.家蝇幼虫清蛋白的免疫药理活性研究  从非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫三个方面进行了动物体内实验,家蝇幼虫清蛋白能刺激正常小鼠免疫器官的增长,增强正常小鼠的巨噬细胞非特异性吞噬能力和血清溶血素活性,能促进脾脏和胸腺中Con A活化和未活化的T淋巴细胞、脾脏中LPS活化的B淋巴细胞增殖,并能显著增强脾NK细胞对肿瘤细胞YAC-1的杀伤作用。实验结果表明家蝇幼虫清蛋白具有良好的免疫调节功能。  3.家蝇幼虫抗病毒蛋白的分离纯化及其理化特性研究  采用离子交换色谱DEAE-52、凝胶过滤色谱Sephadex G-100和Sephadex G-75柱层析,从家蝇幼虫清蛋白中分离获得了一种对昆虫病毒AcMNPV和BmNPV具有良好抗病毒活性的蛋白级分HAP。紫外扫描分光光度分析、层析法、电泳法和反相高效液相色谱鉴定其为具有色谱纯和电泳纯的样品。HAP还具有良好的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除活性,并能在体外细胞水平上显著促进小鼠淋巴细胞的增殖,显示了较强的体外抗氧化活性和免疫调节功能。  4.家蝇幼虫抗病毒蛋白的分子构象分析  采用紫外光谱、红外光谱、荧光光谱和圆二色谱等分析技术研究了HAP在溶液中的分子构象。实验结果显示,HAP具有典型的蛋白质紫外吸收光谱图,在280nm波长附近有最大吸收峰;二级结构主要以β-折叠和无规卷曲结构为主,α-螺旋结构含量较少,β-折叠结构含量为79.1%,无规卷曲结构含量为17.3%,α-螺旋结构含量为3.6%;HAP最大发射波长在332nm处,最佳激发波长为283nm。  5.副产物几丁糖的生物活性研究  将已提纯过清蛋白的家蝇幼虫残渣进一步分离获得了活性物质几丁糖,并对其生理活性功能和理化特性进行了分析研究,实验结果表明家蝇幼虫几丁糖具有良好的还原力、金属离子鏊合能力以及清除自由基活性,其作用效果与阳性对照抗坏血酸和EDTA相似。家蝇幼虫几丁糖对七种植物病原真菌(棉花立枯病、弯孢霉、花生白绢病、水稻纹枯病、油菜菌核病、番茄叶霉病和匍枝根霉)均具有抗菌活性,其中对匍枝根霉的作用效果最佳,半数抑制浓度IC50为0.20mg/mL。此外,在体外细胞水平上家蝇幼虫几丁糖对两种肿瘤细胞(Hela细胞和S-180细胞)的增殖也具有良好的抑制作用,均呈现剂量效应关系。  
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