两种微藻天然产物营养与健康功能的研究

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功能食品研发已经成为食品行业以及大健康产业中最活力和潜力的热点领域。挖掘、开发具有营养与健康功能的新型食品材料可有力推大健康产业发展。微藻是一类广泛生存于各种水体的单细胞光合微生物,其细胞可合成包括多糖、色素在内的各种独特的天然化合物,是研制功能食品的优质资源库。以螺旋藻多糖(Polysaccharide from Spirulina platensis,PSP)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)虾青素(Astaxanthin,AST)为代表的特色微藻产物具有多种生物学活性,具有成为功能食品及新型天然药物的巨大潜力。然而,目前对于PSP和AST的活性研究大多集中于抗氧化、抗肿瘤等领域,现有研究缺乏对PSP和AST精准营养与健康功能鉴定及相关分子机理解析。本研究提取、纯化获得高纯度的PSP和AST,以ICR小鼠为模式动物,探究PSP和AST分别对慢性功能性便秘和急性肝损伤两种消化系统疾病的治疗作用机理,以期发现并解析PSP和AST新的营养与健康功能。主要研究结果如下:(1)采用超声破碎藻细胞-水提法提取PSP,经柱层析法提纯获得纯度为89.72%的螺旋藻多糖。采用高效凝胶渗透色谱法(High performence gel permeation chromatography method,HPGPC)和柱前衍生化高效液相色谱法(The PMP precolumn derivatization HPLC method,PMP-HPLC)测得螺旋藻多糖分子量为29600 Da,主要单糖组成及百分比为鼠李糖(24.7%)、葡萄糖(16.15%)、半乳糖(13.32%)、核糖(9.7%)、岩藻糖(6.742%)、木糖(5.4%)、葡萄糖醛酸(5.3%)、半乳糖醛酸(3.34%)以及阿拉伯糖(2.648%)。来源于雨生红球藻的虾青素酯皂化产物经柱层析法提纯后,采用高效液相色谱法测得其纯度达94.90%,其中顺式虾青素占1.40%,反式虾青素占93.50%。(2)采用地芬诺酯灌胃法建立小鼠慢性便秘模型。造模成功后,以50 mg/kg BW、100 mg/kg BW及200 mg/kg BW的剂量梯度灌胃螺旋藻多糖进行治疗,采用50 mg/kg BW的酚酞作为阳性对照。每天计数排便量、统计首次黑便时间,试验结束后采用试剂盒法测定小鼠肠道组织中的乙酰胆碱酯酶(acetylcholin esterase,Ach E)和一氧化氮(nitric oxide,NO)两种神经递质的含量,基于重量法测定肠道含水量,收集回肠组织制备病理切片。试验结果表明,不同浓度的螺旋藻多糖均可降低NO浓度,促进肠道蠕动性,减缓便秘症状。其中低浓度多糖可显著提高Ach E活性。所有治疗均可减少便秘情况下的肠道含水量。不同剂量的螺旋藻多糖均可显著缓解肠道绒毛受损程度,减轻炎性浸润及固有层水肿,增加绒毛杯状细胞。螺旋藻多糖对便秘的治疗效果为剂量依赖性。(3)通过qPCR和16s rDNA微生物多样性测序分析小鼠肠道神经递质相关基因的表达及肠道微生物群落的变化。试验表明,与模型组相比,不同浓度的PSP可以显著下调诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、瞬时受体电位香草酸受体1(Transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)及结肠水通道蛋白3(Aquaporin protein3,AQP3)的表达。低剂量PSP可显著上调Ach E基因表达水平。微生物群落测序表明,与便秘组相比,PSP对肠道菌群有明显的改善作用,增加了有益菌Akkermansia,Lactobacillus,Butyricimonas,Candidatus Arthromitus和Prevotella的丰度,降低了有害菌Clostridium和Dorea的丰度。(4)采用腹腔注射化疗药阿霉素建立小鼠肝损伤模型,设置50 mg/kg BW和100mg/kg BW剂量的虾青素灌胃治疗。在造模过程中,模型小鼠表现出食欲下降、体重减轻、腹水及谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)增加的症状,表明化疗肝损伤造模成功。试验结束后,采用干化学法测定尿常规指标、试剂盒法测定小鼠肝功能四项、收集肝脏样本制备病理切片,并采用TUNEL反应观察肝细胞凋亡情况。结果表明,虾青素可有效缓解阿霉素所引起的食欲不振及体重减轻,同时降低肝功能四项、缓解肝细胞气球样变及染色质浓缩、降低肝细胞的凋亡程度,表现出极强的保肝作用,且该保护效果为剂量依赖性。(5)使用试剂盒法、荧光分光光度法测定小鼠肝脏中总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,TAOC)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)的酶活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量。采用qPCR法测定Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)、核因子相关因子E2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶(Heme Oxygenase-1,HO1)及下游SOD,CAT,GPX的表达。研究发现,虾青素可提高肝细胞抗氧化能力,表现为增加SOD,CAT,GPX的酶活性,降低胞中MDA和ROS的含量。在转录水平上,虾青素可通过激活转录因子Nrf2,上调下游抗氧化蛋白基因的表达。总之,本研究表明,螺旋藻多糖可通过基于肠-脑轴途径调理肠道微生物多样性、改变肠道蠕动相关神经递质的含量、减轻便秘造成的绒毛损害等途径改善便秘症状。虾青素可通过调控Keap1/Nrf2信号通路促进下游抗氧化酶的表达,提高细胞抗氧化能力,进而缓解肝细胞凋亡及坏死。本研究发现了PSP、AST两种微藻天然产物新型生物活性功能,初步阐述了相关作用机理,为基于微藻天然产物的功能食品及药品研发奠定了新的科学基础。
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