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背景在我国,食管癌是高发的恶性肿瘤之一,病理学类型仍以鳞状细胞癌为主。目前虽然在食管癌流行病学、早期诊断、综合治疗及预防等方面有了很大的进展,但是食管癌的死亡率仍然很高。恶性肿瘤的形成是一个多阶段逐步发展的过程,与遗传学突变和环境因素有关,在内源性的突变基因和外源性促癌因素共同驱动下,很多肿瘤细胞逐渐进展为临床上可见的病理学形态。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活在肿瘤发生和发展中起重要作用。通过我们前期研究,对10对食管鳞癌及癌旁正常组织CDNA芯片的47000个转录子及变异型表达情况的比较分析[1],发现数个差异性表达上调基因:DMRT2、CTTN、MCM10和SCYA26。其中DMRT2基因属于DM基因(double-sex and mab-3 relatated transcription factor)家族,表达一类转录因子,主要功能是调控性别的发育和分化。而有研究发现,在非小细胞肺癌、乳腺癌及肾透明细胞癌中[2-4],该基因表达缺失。为了推测DMRT2在食管鳞癌中的生物学功能作用,本研究将基于食管鳞癌细胞水平,应用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除食管鳞癌细胞株中DMRT2基因,利用功能实验探究DMRT2在食管鳞癌中的生物学作用。目的本研究拟应用CRISPR/Cas9技术建立DMRT2敲除食管鳞癌细胞株,探讨DMRT2在肿瘤细胞中的生物学功能。研究方法(1)培养5株食管鳞癌细胞系;利用Westernblot筛选出DMRT2高表达的细胞系;(2)在DMRT2 exon上设计sg RNA及reporter(包含sg RNA序列及荧光标记,可用于筛选敲除的阳性细胞)。构建重组质粒PGL3-U6-sg RNA及pm CherryEGFP-reporter。酶切验证重组质粒的连接情况。LIP2000法将上述两种质粒及Cas9质粒(为郑州大学中英分子实验室Professor Du友情提供)共转染工具细胞JH293,筛选出内源活性sg RNA。另用LIP2000法将EGFP质粒转染食管鳞癌细胞,筛选最佳转染比例。(3)LIP2000法将上述验证具有内源活性sg RNA、reporter与Cas9质粒共转染食管鳞癌EC109细胞(DMRT2蛋白高表达),根据载体中荧光蛋白表达情况,荧光显微镜下观察,最终经流式分选,收集单个细胞到96孔板,培养单克隆细胞。(4)提取存活的单克隆细胞基因组。在sg RNA对应细胞基因组序列的上下游设计引物,pcr出该片段,连接T-SIMPLE,转化大肠杆菌超级感受态,摇菌扩大培养,菌液送基因测序,同时提取单克隆细胞的蛋白,Westernblot验证DMRT2敲除情况。(5)利用本实验室Incu Cyte ZOOM仪器,进行相关细胞功能实验,包括:细胞增殖实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验等。此外利用流式检测分析早期细胞凋亡比例,最后统计分析数据,推测该基因对细胞增殖、迁移及凋亡的影响。研究结果(1)半定量Westernblot法分析5株食管鳞癌细胞株中DMRT2蛋白表达情况,其中高表达细胞株:EC109、EC9706、K30、HKESC1,低表达细胞株:K510。(2)EGFP质粒转染EC109细胞,得出最佳转染比例为1:4,在DMRT2 exon上设计处数个sg RNA,分别转染工具细胞,最终筛选出内源活性最好的sg RNA3:accggagctggaagaggacgtctg。将验证内源活性的重组质粒共转染EC109,经流式分选,培养单克隆细胞,再通过基因测序及Westernblot验证,最终得到DMRT2敲除细胞株1株,部分敲除细胞株4株。(3)选择DMRT2敲除的细胞株EC109 1-8(-/-)和敲低细胞株4-8(+/-)与野生型EC109进行功能实验比较。结果如下:(1)细胞增殖实验EC109 1-8(-/-)和4-8(+/-)比野生型EC109细胞增殖能力强,差异有统计学意义。(2)划痕迁移实验通过观察三组的迁移速率,发现早期野生型EC109较EC109 1-8(-/-)和4-8(+/-)迁移速率快,但24h以后EC109 1-8(-/-)和4-8(+/-)细胞迁移速率加快,野生型EC109迁移速率减慢。(3)侵袭实验加入Matrigel胶后比较各组侵袭速率,发现三组迁移速率差异不明显。(4)流式检测凋亡实验先用0.2mmol/L双氧水诱导细胞凋亡12小时后,凋亡试剂盒检测,流式分析显示EC109 1-8(-/-)和4-8(+/-)细胞早期凋亡比率多于野生型EC109细胞。结论:1.DMRT2基因参与肿瘤细胞增殖、迁移,并且抑制肿瘤细胞增殖、迁移能力。2.DMRT2基因参与肿瘤细胞早期凋亡过程,并且抑制肿瘤细胞凋亡。