蛋白质的N-糖基化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰类型，几乎参与了所有重要的生命过程，例如在真核生物的受精、发育、物质代谢、细胞间识别及通讯等中均有糖基化修饰的发生。同时也有研究表明，蛋白质的N-糖基化修饰存在于多种重大疾病的发生及发展过程中，例如糖尿病、心力衰竭、神经系统疾病及恶性肿瘤等。因此，针对蛋白质N-糖基化修饰的研究对许多生理过程的认知具有重要的意义；同时也对很多疾病，尤其是恶性肿瘤的研究具有重要的临床指导价值。但是由于糖蛋白本身都是低丰度表达的蛋白质，同时糖链具有微不均一性及缺乏可以产生紫外吸收的官能团并且亲水性较强，为蛋白质的糖基化分析带来一定的挑战。因此，迫切需要发展简便、快速及特异的N-糖蛋白、糖肽及糖链的富集检测方法，以满足高通量、高灵敏度及规模化的蛋白质糖基化分析。基于以上提出的问题，本论文以探索N-糖蛋白、糖肽及糖链的高效分离富集新技术新方法为主要内容，开创性地设计合成了功能化石墨烯材料、酰肼功能化的温度敏感聚合物及pH敏感聚合物材料并将其成功用于人血浆、小鼠肝脏及小鼠脑蛋白等复杂生物样本中糖蛋白N-糖链和糖肽的高效富集检测，使蛋白质糖基化的鉴定规模得到了显著提高。第一章介绍了糖蛋白组学的国内外研究现状，包括现有的针对N-糖蛋白、糖链及糖肽的分离富集技术并重点介绍了肼化学法在蛋白质糖基化富集鉴定中的应用。第二章介绍了一种基于石墨烯的糖蛋白N-糖链一步法富集-衍生化处理方法。该方法利用石墨烯可以与芳香族化合物发生π-π共轭相互作用同时含酰肼的芳香族化合物可以和N-糖链的半缩醛发生特异性共价偶联反应，创新性地将N-糖链的富集、衍生化及脱盐步骤整合为一步，减少了繁杂的操作步骤，提高了样品处理通量并显著降低了样品损失。通过该一步法使麦芽七糖在MALDI-TOF MS中的检测灵敏度提高了33倍并且在人血浆中成功鉴定到48个N-糖型。第三章利用异丙基丙烯酰胺和丙烯酸甲酯在过硫酸钾引发下的自由基聚合物反应，成功合成了酰肼功能化的温度敏感聚合物。通过控制体系温度影响该聚合物在溶液中的状态，使其在N-糖肽的富集过程中处于完全溶解的状态而达到对糖肽的均相高效富集，而在非糖蛋白或者非糖肽去除的步骤中可以从体系中沉淀析出，以达到对非糖肽的有效去除。由于均相反应的介入，大大简化了糖肽富集中的物质交换过程，因此，缩短了反应时间，提高了富集效率。我们将该材料用于牛胎球蛋白和牛血清白蛋白以1:100（w/w）比例进行混合的样本中和小鼠肝脏蛋白样本中N-糖肽的富集。经过富集之后，可以成功鉴定得到牛胎球蛋白的三条N-糖肽，同时牛血清白蛋白中信号较高的非糖肽信号都被成功去除；在小鼠肝脏蛋白样品中共鉴定得到466条N-糖肽，对应213个糖蛋白。第四章利用丙烯酸和丙烯酸甲酯在过硫酸钾引发下的自由基聚合物反应，合成了酰肼功能化的pH敏感聚合物，并将该聚合物用于牛胎球蛋白和牛血清白蛋白以1:100（w/w）比例进行混合的样本中和小鼠脑蛋白样本中N-糖肽的富集。由于该聚合物对N-糖肽的富集过程属于均相反应，因此，大大缩短了酰肼官能团和N-糖肽中醛基反应所需时间，提高了富集速率及效率。在牛胎球蛋白和牛血清白蛋白以1:100（w/w）比例进行混合的样本中，我们成功富集得到牛胎球蛋白的三条N-糖肽并且有效去除了牛血清白蛋白中非糖肽对其检测干扰；在小鼠脑蛋白样品中共鉴定得到条1276条N-糖肽，对应442个糖蛋白，进一步计算得到该聚合物对N-糖肽的富集效率高达65%。这也进一步说明本论文所合成的酰肼功能化温度敏感聚合物和pH敏感聚合物不仅对N-糖肽的富集效率较高而且特异性较好，在蛋白质糖基化组学研究中具有广阔的应用前景。